一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法。本发明所述微流控芯片包括偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球、异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体以及芯片盒，还可以包括梯度浓度的大肠杆菌菌悬液、磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液及磁铁。本发明基于免疫磁珠技术对水中大肠杆菌进行了准确、简便的含量检测，检测周期短，程序简单易操作，能够适应污染源快速诊断的需要。
【专利说明】—种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌(Escherichia coli)是指示水体中粪便污染的最重要细菌学指标之一，相对于总大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌对粪便污染的指示作用最强。目前，世界各国及国际组织都将大肠杆菌作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，大肠杆菌在任意IOOmL用于饮用的水中不得检出；现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定大肠杆菌的限值为OCFU/ml ;中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》规定，大肠杆菌在每IOOmL水样中不得检出。
[0003]大肠杆菌(E.coli 0157:H7)是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，此菌在世界范围内发生过多次暴发，并造成严重危害。它能引起人类出血性腹泻，并发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫瘢(TTP)等，老人和儿童并发HUS时病死率可高达50%。因此，做好水中E.coli 0157:H7的检测具有重要的意义。
[0004]检测大肠杆菌的传统方法主要有多管发酵法和滤膜法。多管发酵法适用于各种样品，但操作复杂，检测时间较长，滤膜法主要用于检测杂质较少的水样，操作比多管发酵法更为简单，但是不适合检测高浊度和其他复杂水样。这两种方法都具有检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。目前，国内外研究人员已经发展了一些新方法进行大肠杆菌的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫分析法、生物传感器法等。
[0005]与传统方法相比，这些方法虽然缩短了一定的检测时间，但是仍然不能满足快速检测的需要，如申请号201010284474.5的快速检测大肠杆菌的方法及所用到的微流控芯片及其制备工艺。该方法基于电化学与电测量技术的电化学生物传感技术以及免疫荧光技术对样品中的大肠杆菌(E.coli 0157:H7)进行了快速检测，但是该技术在实际检测中除荧光检测装置外还需要一些电极和电子设备，仍不能更方便的快速的检测大肠杆菌(E.coli0157:H7)o
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法，使得通过本发明所述微流控芯片能够快捷、方便、准确检测出水中大肠杆菌含量。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0008]一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片，包括:
[0009]偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大肠杆菌抗体以及芯片盒；
[0010]所述芯片盒由下部基片和上部盖板组成，其内刻有检测反应主通道以及和检测反应主通道相连接的添加试剂的分通道，所述检测反应主通道和添加试剂的分通道均设有可开关的开口。
[0011]作为优选，所述添加试剂的分通道为5个，呈放射状与检测反应主通道相连接，示意图见图1。
[0012]作为优选，所述芯片盒规格为10mmX5mmX2mm，所述检测反应主通道规格为8mmX 200 μ mX 40 μ m。
[0013]作为优选，本发明所述微流控芯片还包括:梯度浓度的大肠杆菌菌悬液、磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液及磁铁。其中，所述磁铁优选为电磁铁，可直接安装到芯片盒上，通电时有磁性，断电时无磁性。
[0014]作为优选，所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球为偶联有大肠杆菌兔抗的磁性微球，异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体为异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌鼠抗。
[0015]作为优选，所述洗涤液由0.05mol/L磷酸缓冲液和体积百分比为0.05%的吐温组成，pH 为 7.2。
[0016]作为优选，所述大肠杆菌为E.coli 0157:H7。
[0017]作为优选,所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球浓度0.8mg/ml,所述异硫氰酸突光素标记的大肠杆菌抗体浓度50 μ g/mlo
[0018]此外，本发明还提供一种检测水中大肠杆菌的方法，包括以下步骤:
[0019]步骤1、在芯片盒上设置磁铁，所述芯片盒由下部基片和上部盖板组成，其内刻有检测反应主通道以及和检测反应主通道相连接的添加试剂的分通道，所述检测反应主通道和添加试剂的分通道均设有可开关的开口 ；
[0020]步骤2、将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过磁铁将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球固定于微流控芯片主通道内，然后将已知浓度的大肠杆菌菌悬液也通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道；
[0021]步骤3、488nm激发光照射检测反应主通道，检测525nm荧光强度，获得荧光强度值Fl ；
[0022]步骤4、将异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过添加试剂的分通道泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度稳定，获得荧光强度值F2，计算获得检测荧光强度值F=F2-F1 ；
[0023]步骤5、断电消除磁铁磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度接近空白值；
[0024]步骤6、按照步骤1-步骤5的方法，用梯度浓度的大肠杆菌菌悬液分别获得多个荧光强度值F，然后获得不同浓度大肠杆菌菌悬液的浓度对数值与对应检测荧光强度的标准曲线；
[0025]步骤7、将待测水样按照步骤1-步骤5的方法获得检测荧光强度值，代入到步骤6得到的标准曲线中获得水中大肠杆菌的浓度。
[0026]所述标准曲线可经软件计算得到计算方程，直接带入计算。
[0027]本发明所述方法检测原理为:
[0028]利用微流控芯片外部的磁铁来固定偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球，接着捕获大肠杆菌，然后再用异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体标记所捕获的大肠杆菌，检测其荧光强度，如此制作标准曲线以及检测待测水样荧光强度，获得待测水样的大肠杆菌含量，最后断电消除磁铁磁性，用洗涤液冲洗检测反应主通道，准备进行下一次检测。
[0029]其中，作为优选，所述添加试剂的分通道为5个，呈放射状与检测反应主通道相连接，不意图见图1。
[0030]作为优选，所述芯片盒规格为10mmX5mmX2mm，所述检测反应主通道规格为8mmX 200 u mX 40 U m。
[0031]作为优选，所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球为偶联有大肠杆菌兔抗的磁性微球，异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体为异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌鼠抗。
[0032]作为优选，所述洗涤液由0.05mol/L磷酸缓冲液和体积百分比为0.05%的吐温组成，pH 为 7.2。
[0033]作为优选，所述大肠杆菌为E.coli 0157:H7。
[0034]作为优选，所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球浓度0.8mg/ml，所述异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体浓度50 V- g/mlo
[0035]取同一检测水样分别进行检测，本发明检测方法检测结果为52cfu/ml，而传统滤膜法检测结果为52cfu/ml。两者数据没有明显差异，表明本发明检测方法准确度很高。
[0036]此外，经过对比检测，本发明方法最低检出大肠杆菌浓度为5cfu/ml，检测范围为5至lX108cfu/ml，整体耗时为30min左右；而申请号201010284474.5的方法最低检出大肠杆菌浓度为6.4cfu/ml，线性范围为6.4至I X 107cfu/ml，整体耗时大于80min。
[0037]由以上技术方案可知，本发明基于免疫磁珠技术对水中大肠杆菌进行了准确、简便的含量检测，检测周期短，程序简单易操作，能够适应污染源快速诊断的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1所示为本发明所述芯片盒结构示意图，其中A所示为添加试剂的分通道，B所示为检测反应主通道；
[0039]图2所示为不同浓度大肠杆菌菌悬液的浓度对数值与对应检测荧光强度的标准曲线，其中Ctl为大肠杆菌菌悬液的浓度。
【具体实施方式】
[0040]本发明公开了一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0041]以下就本发明所提供的一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片以及方法做进一步说明。
[0042]实施例1:大肠杆菌0157:H7菌悬液的制备
[0043]将经多次挑单菌落纯化的0157:H7菌种在LB琼脂斜面上37°C培养20h，用0.5%福尔马林无菌生理盐水洗脱下来，9000r/min离心IOmin后弃上清液，再用无菌生理盐水重复清洗两次，然后制成浓度为I X IO7-1 X 108/ml菌悬液。然后放入100°c水浴中煮沸3h。取出待冷却后放入冰箱冷减备用。
[0044]实施例2:偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球的制备
[0045]选取健康的新西兰大耳兔，实施例1中灭活大肠杆菌菌悬液与弗氏不完全佐剂(1:1)乳化,于皮下注射免疫原,初次免疫剂量Iml/只，皮下分点注射；3次追加免疫剂量均为0.2ml/只，不加佐剂，最后一次免疫后8天颈动脉放血法采血分离血清。
[0046]采用正辛酸-饱和硫酸铵法提取兔抗大肠杆菌免疫血清IgG。两步沉淀法:先加正辛酸去杂蛋白，后加硫酸铵使抗体沉淀。凝胶层析脱盐后在进行超滤离心浓缩得到纯化兔抗大肠杆菌兔抗作为捕获抗体，并用280nm和260nm的吸收差法测定蛋白浓度。
[0047]配制0.llmol/L的磷酸缓冲液(PBS,pH=7.2)、0.5mol/L氨基己酸溶液及0.05wt%的吐温混合液作为活化液。取200 μ L的活化液加入2mg的磁性微球，加入2mg的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)，室温混匀反应15min。重复3次。
[0048]配制0.05mol/L磷酸缓冲液和0.05%吐温的混合液(pH=7.2)作为洗涤液。用200 μ L的洗涤液洗涤已活化的磁球I次。加入兔抗大肠杆菌抗体，室温下偶联反应2h。
[0049]洗涤已偶联的磁球3次。加入200 μ L含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.3%甘氨酸(Gly)的包被液，室温反应45min。洗涤已包被的磁球3次。加入200 μ L含有2%BSA的封闭液，放入4°C冰箱保存待用。
[0050]实施例3:异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体的制备
[0051]选取健康豚鼠，实施例1中灭活大肠杆菌菌悬液与弗氏不完全佐剂(1:1)乳化，初次免疫注射加入完全佐剂(1:1)，第2次加入不完全佐剂(1:1)。豚鼠抗原免疫I?3次均注射于四肢大腿内侧皮下淋巴结，均采用多点注射法。第4、5、6次注射加强，进行腹腔注射。于次日注射后第7天抽血，用特异性抗原测定效价，心脏放血，分离纯化抗体作为检测抗体进行下一步FITC标记。
[0052]取大肠杆菌鼠抗的适量体积溶液，蛋白总量为lmg，用pH9.0的碳酸盐缓冲液对抗体溶液进行透析，使蛋白处于碱性环境中。用FITC对该抗体进行标记。其中FITC与蛋白质含量比值为1:10，向反应体系中逐滴滴入溶于二甲基亚砜的FITC，按照反应条件为4°C、2h，20°C、4h，37°C、30min，避光反应进行FITC标记。反应完成后用超滤离心管9000r/min离心反应液lOmin，重复该操作，每次收集离出液，测定荧光值(F488/525)，直至离出液无荧光值。测定标记后检测抗体的F488/525值。
[0053]实施例4:本发明所述微流控芯片
[0054]梯度浓度的大肠杆菌0157:H7菌悬液(浓度C0: 10U02U03U0\IO5UO6UO7UO8,109cfu/ml)、浓度为50 μ g/ml异硫氰酸突光素标记的大肠杆菌鼠抗、0.8mg/ml偶联有大肠杆菌兔抗的磁性微球、0.05mol/L磷酸缓冲液和体积百分比为0.05%的吐温组成的洗涤液(ρΗ7.2)、磁铁、芯片盒；
[0055]所述芯片盒由下部基片和上部盖板组成，其内刻有检测反应主通道以及和检测反应主通道相连接成放射状分布的5个添加试剂的分通道，所述检测反应主通道和添加试剂的分通道均设有可开关的开口，示意图见图1。
[0056]实施例5:本发明所述方法
[0057]采用实施例4中的微流控芯片。[0058]在芯片盒上设置磁铁，将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过磁铁将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球固定于微流控芯片主通道内，然后将已知浓度的大肠杆菌菌悬液也通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道；
[0059]488nm激发光照射检测反应主通道，检测525nm荧光强度，获得荧光强度值Fl ；
[0060]将异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过添加试剂的分通道泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度稳定，获得荧光强度值F2，计算获得检测荧光强度值F=F2-F1 ；
[0061]断电消除磁铁磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度接近空白值；
[0062]按照前述获得检测荧光强度值F的方法，用梯度浓度的大肠杆菌菌悬液分别获得多个荧光强度值F，然后获得不同浓度大肠杆菌菌悬液的浓度对数值与对应检测荧光强度的标准曲线(见图2);
[0063]将待测水样按照步骤1-步骤5的方法获得检测荧光强度值，代入到标准曲线中获得水中大肠杆菌的浓度。
[0064]实施例6:待测水样中大肠杆菌含量的检测
[0065]检测方法:实施例5检测方法以及本领域传统的滤膜法
[0066]取同一检测水样分别进行检测，本发明检测方法检测结果为52cfu/ml，而传统滤膜法检测结果为52cfu/ml。两者数据没有明显差异，表明本发明检测方法准确度很高。
[0067]此外，经过对比检测，本发明方法最低检出大肠杆菌浓度为5cfu/ml，检测范围为5至lX108cfu/ml，整体耗时为30min左右；而申请号201010284474.5的方法最低检出大肠杆菌浓度为6.4cfu/ml，线性范围为6.4至I X 107cfu/ml，整体耗时大于80min。
[0068]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种检测水中大肠杆菌的微流控芯片，其特征在于，包括: 偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球、异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体以及芯片盒； 所述芯片盒由下部基片和上部盖板组成，其内刻有检测反应主通道以及和检测反应主通道相连接的添加试剂的分通道，所述检测反应主通道和添加试剂的分通道均设有可开关的开口。
2.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，还包括: 梯度浓度的大肠杆菌菌悬液、磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液及磁铁。
3.根据权利要求2所述微流控芯片，其特征在于，所述洗涤液由0.05mol/L磷酸缓冲液和体积百分比为0.05%的吐温组成，pH为7.2。
4.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli0157:H7o
5.根据权利要求1-4任意一项所述微流控芯片，其特征在于，所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球浓度0.8mg/ml。
6.根据权利要求1-4任意一项所述微流控芯片，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体浓度50 μ g/mlo
7.—种检测水中大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、在芯片盒上设置磁铁，所述芯片盒由下部基片和上部盖板组成，其内刻有检测反应主通道以及和检测反应主通道相连接的添加试剂的分通道，所述检测反应主通道和添加试剂的分通道均设有可开关的开口； 步骤2、将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过磁铁将偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球固定于微流控芯片主通道内，然后将已知浓度的大肠杆菌菌悬液也通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道； 步骤3、488nm激发光照射检测反应主通道，检测525nm荧光强度，获得荧光强度值Fl ； 步骤4、将异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌抗体通过添加试剂的分通道泵入到检测反应主通道，通过添加试剂的分通道泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度稳定，获得荧光强度值F2，计算获得检测荧光强度值F=F2-F1 ； 步骤5、断电消除磁铁磁性，解除磁性微球的固定，再次泵入磷酸缓冲液和吐温组成的洗涤液冲洗整个检测反应主通并排出，直至525nm荧光强度接近空白值； 步骤6、按照步骤1-步骤5的方法，用梯度浓度的大肠杆菌菌悬液分别获得多个荧光强度值F，然后获得不同浓度大肠杆菌菌悬液的浓度对数值与对应检测荧光强度的标准曲线.步骤7、将待测水样按照步骤1-步骤5的方法获得检测荧光强度值，代入到步骤6得到的标准曲线中获得水中大肠杆菌的浓度。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述洗涤液由0.05mol/L磷酸缓冲液和体积百分比为0.05%的吐温组成，pH为7.2。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli0157:H7o
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述偶联有大肠杆菌抗体的磁性微球浓度.0.8mg/ml,所述异硫氰酸突光素标记的大肠杆菌抗体浓度50 μ g/mlo
【文档编号】G01N21/64GK103777013SQ201410069183
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】单旭亮, 毛芳芳, 崔海松 申请人:杭州绿洁水务科技有限公司