一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，涉及植物内源细胞分裂素的测定领域。本发明包括以下步骤：①内源细胞分裂素的提取：通过加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成內源细胞分裂素的提取；②固相萃取洗脱：溶解内源细胞分裂素并获得溶解液，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③高效液相色谱-质谱分析。本发明前处理简单，化学试剂用量少，有效节约成本，杂质干扰小；检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生；实现了在植物样品的粗提取液中直接进行多种內源细胞分裂素的检测；其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法适用于草坪草内源细胞分裂素，回收率高，达93～96%。
【专利说明】一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物内源细胞分裂素的测定领域，具体涉及一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法。
【背景技术】
[0002]草坪业基于其独特的生态、社会、景观、美学和经济等功能，越来越受到重视并显示出巨大的发展势头和潜力。草坪作为城市生态系统的重要组成部分，不仅具有很强的观赏性和娱乐性，同时也在防治污染和改善生态环境中发挥了巨大的作用，鉴于此，社会对草坪草的需求不断增大，草坪业的发展也迎来了良好的机遇。在雾霾频发的今天，如何改善我们的居住生活环境任重而道远，草坪草在环境改善方面的作用也显得举足轻重。
[0003]植物内源细胞分裂素作为一种以促进细胞分裂为主的植物激素，普遍存在于高等植物中，可显著调节植物的生长发育，对细胞分裂和分化具有重要作用。虽然内源细胞分裂素在植物体内的含量低，但对植物的新陈代谢、生长发育等生理过程起到重要的调节作用，包括促进细胞分裂、促进芽的分化、促进细胞扩大、促进侧芽发育、消除顶端优势、延缓叶片衰老、打破种子休眠和种子发芽等。近年来，关于内源细胞分裂素在提高植物抗逆性中的作用也受到了重视。如何精确、实时和可靠地对不同物种中微量的内源细胞分裂素进行定性定量分析，是目前植物激素研究中的热点之一。
[0004]细胞分裂素在大多数组织中的含量都很低，通常在10-6?10_9g之间，因此，对分析灵敏度的要求较高。七十年代初Pool首先利用高效液相色谱(HPLC)分离鉴定细胞分裂素，高效液相色谱技术满足了植物细胞分裂素测定的灵敏度要求，且具有高选择性、分析快速、兼具分析和制备的优点在植物内源细胞分裂素的分离和测定中得到广泛的应用。但在样品的提取、纯化等前处理过程仍有很多问题难以解决，样品的前处理是一个耗时耗力的过程，特别是杂质的干扰，一直是HPLC法测定细胞分裂素的瓶颈。因此改进细胞分裂素测定过程中的前处理及纯化方法，对准确测定细胞分裂素尤为关键。
[0005]近年来，质谱技术的快速发展，推动了植物内源细胞分裂素的精确分析测定。质谱法具有高选择性、高灵敏度、能提供相对分子量和结构信息的优点，国外已有学者将液相色谱与质谱相结合应用于植物激素的检测，虽然此项技术刚刚起步，但可预见其在植物激素的检测中将发挥重要的作用。
[0006]液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术具有如下优点:
[0007]①检测限低、灵敏度高、选择性好，不需要衍生，化学试剂用量少；
[0008]②实现了在植物样品的粗提取液中直接进行生理水平植物激素的检测。
【发明内容】
[0009]本发明的目的主要是针对植物内源细胞分裂素检测的操作复杂、耗时长、纯化难度大、检测种类少和回收率低等问题，提供一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法。本发明的特色是前处理简单，不需要衍生，节约成本，尤其适用于草坪草内源细胞分裂素的测定，可快速、准确测定草坪草的多种内源细胞分裂素。
[0010]本发明的目的是这样实现的:
[0011]一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，主要包括以下步骤:
[0012]①内源细胞分裂素的提取:
[0013]通过加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成内源细胞分裂素的提取；
[0014]②固相萃取洗脱:
[0015]溶解内源细胞分裂素并获得溶解液，过96孔的固相萃取小柱(Oasis MCX column)逐步洗脱，获得内源细胞分裂素洗脱液，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；
[0016]③高效液相色谱-质谱分析:
[0017]将固相萃取洗脱物用流动相溶解，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)进样分析。
[0018]本发明具有下列优点和积极效果:
[0019]①前处理简单，化学试剂用量少，有效节约成本，杂质干扰小；
[0020]②检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生；
[0021]③实现了在植物样品的粗提取液中直接进行多种内源细胞分裂素的检测；
`[0022]④其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法适用于草坪草内源细胞分裂素，回收率高，达93~96%。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是细胞分裂素(iP、Z、DHZ、iPA、ZR、DHZR)混合标样质谱图；
[0024]图2是狗牙根叶片细胞分裂素(丨？、2、0!12、丨?4、21?、0!1210质谱图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例详细说明:
[0026]1、试验材料:经盐胁迫(处理浓度为200mmol/L NaCl)处理35d (天)的狗牙根材料(选用中国科学院武汉植物园种质资源圃编号为C43的狗牙根)。
[0027]2、检测步骤
[0028]I)内源细胞裂素的提取
[0029]A、浸提:取0.5g鲜样，用液氮研磨，然后加提取液5ml，_20°C提取过夜，得浸提液；
[0030]所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4，按v/v，再加40mg/ml2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚作为抗氧化剂；
[0031]B、离心:将浸提液在15000转/min，4°C下离心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，残渣再用5ml提取液于_20°C提取lh，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；
[0032]C、过滤:将收集的离心液过20 μ m滤膜以去除残渣和较小的颗粒物，收集滤液，得过滤液；
[0033]D、脱色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱(S^)-Pak PlusC18cartridge),然后将过滤液通过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取小柱(载量为100mg/ml),并连接上真空泵，以lml/min的速度抽滤，以去除色素和脂类物质；过小柱后，收集滤液，再用Iml的样品提取液洗脱小柱中的样品并收集滤液，得脱色滤液；
[0034]E、真空浓缩:
[0035]将收集的脱色滤液置于真空浓缩仪中，于40°C浓缩至完全干燥，即完成内源细胞分素的提取。
[0036]2)固相萃取洗脱:
[0037]A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以获得甲酸溶解液；
[0038]B、分别用lmllOO%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取小柱(Oasis MCX column,载量为60mg/ml),然后将甲酸溶解液过小柱以吸附激素，弃滤液；
[0039]C、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集滤液，该收集液中含有细胞分裂素 Z、ZR、DHZ、DHZR、iP 和 iPA ；
[0040]D、将洗脱液置于真空浓缩仪中40°C浓缩至完全干燥；
[0041]E、过程B和C需将96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取柱置于真空抽滤装置上并连接真空泵，以lml/min的速率进行抽滤，以提高洗脱效率。
[0042]3 )高效液相色谱-质谱(HPLC-MS )连用分析:
[0043]A、将真空浓缩获得的沉淀用200~500 μ I流动相溶解，得流动相溶解液；
[0044]B、用一次性医用注射器吸取流动相溶解液过0.22 μ m滤膜后装至进样瓶中，上液相色谱-质谱(HPLC-MS)进样分析；
[0045]C、如样品量过少，样品装入带内撑管的进样瓶中进行上机分析；
[0046]D、液相色谱条件为:色谱柱为安捷伦Zorbax SB-C18液相色谱柱(3.5 μ m, 150X2.1mm)，柱温为30°C，流速为200 μ 1/min，紫外检测波长为265nm，进样量为10 μ I ;流动相具体见下表:
[0047]表1细胞分裂素Ζ，ZR，DHZ, DHZR，iP，iPA的流动相
[0048]
【权利要求】
1.一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，其特征包括以下步骤: ①内源细胞分裂素的提取:通过加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成内源细胞分裂素的提取； ②固相萃取洗脱:溶解内源细胞分裂素并获得溶解液，过96孔的固相萃取小柱逐步洗脱，获得内源细胞分裂素洗脱液，将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物； ③高效液相色谱-质谱分析:将固相萃取洗脱物用流动相溶解，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱-质谱进样分析。
2.按权利要求1所述的一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，其特征在于步骤①内源细胞分裂素的提取: A、浸提:取0.5g鲜样，用液氮研磨，然后加提取液5ml，-20°C提取过夜，得浸提液； 所述的提取液即甲醇:甲酸:水=15:1:4,按v/v,再加40mg/ml2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酹作为抗氧化剂； B、离心:将浸提液在15000转/min，4°C下离心10min，收集上清液置于新管并保存于-20°C，残渣再用5ml提取液于_20°C提取lh，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液； C、过滤:将收集的离心液过20μ m滤膜以去除残渣和较小的颗粒物，收集滤液,得过滤液； D、脱色:先用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后将过滤液过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取小柱，并连接上真空泵，以lml/min的速度抽滤，以去除色素和脂类物质；过小柱后，收集 滤液，再用Iml的样品提取液洗脱小柱中的样品并收集滤液，得脱色滤液； E、真空浓缩: 将收集的脱色滤液置于真空浓缩仪中，于40°C浓缩至完全干燥，即完成内源细胞分裂素的提取。
3.按权利要求1所述的一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，其特征在于步骤②固相萃取洗脱: A、用2mllmol/L甲酸溶解沉淀，以获得甲酸溶解液； B、用lml100%甲醇和lmllmol/L甲酸平衡96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取小柱，然后将甲酸溶解液过小柱以吸附激素，弃滤液； C、用Iml的lmol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，弃滤液； D、用2ml0.35mol/L的氨水冲洗小柱，弃滤液； E、用2ml60%甲醇配制的0.35mol/L的氨水洗柱，收集滤液，该收集液中含有细胞分裂素(Z，ZR, DHZ, DHZR, iP, iPA)； F、将洗脱液置于真空浓缩仪中40°C浓缩至完全干燥； G、过程B至E需将96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取柱置于真空抽滤装置上并连接真空泵，以lml/min的速率进行抽滤，以提高洗脱效率。
4.按权利要求1所述的一种高效分离和测定草坪草内源细胞分裂素的方法，其特征在于步骤③高效液相色谱-质谱连用分析: A、将真空浓缩获得的沉淀用200~500 μ I流动相溶解，得流动相溶解液；B、用一次性医用注射器吸取流动相溶解液过0.22 μ m滤膜后装至进样瓶中，上效液相色谱-质谱进样分析； C、如样品量过少，样品装入带内撑管的进样瓶中进行上机分析； D、色谱柱为安捷伦ZorbaxSB-C18液相色谱柱，柱温为30°C，流速为200 μ 1/min,紫外检测波长为265nm，进样量为10yL ;
【文档编号】G01N30/06GK103884810SQ201410074317
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】傅金民, 胡龙兴, 娄燕宏 申请人:中国科学院武汉植物园