一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
【专利说明】一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸
【技术领域】
[0001]本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种用于定量检测半乳糖凝集素-3 (Gal-3)的胶体金试纸。
【背景技术】
[0002]半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal_3)也称半乳糖结合蛋白_3，分子量为31kD，是半乳糖凝集素家族的重要成员之一。Galectin家族的成员需要满足两个标准:第一对-半乳糖的亲和力；第二在糖识别域(the carbohydrate recognition domain, CRD)有显著序列相似性。Galectin-3有两个功能域:羧基端是糖识别域，包含了 135个氨基酸残基；氨基端包含100?150个氨基酸残基，由富含脯氨酸和甘氨酸的9个氨基酸残基串联重复组成。Galectin-3主要在巨噬细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞及肥大细胞中表达。其功能依据其在细胞内的定位。在静止细胞内主要存在于胞浆，而在增殖细胞中则主要存在于细胞核。Galectin-3参与调节细胞生长，抗凋亡，介导细胞黏附，参与血管形成及炎症反应等生物学功能。研究表明半乳糖凝集素-3是心肌纤维化标志物，与心力衰竭的发生和死亡风险增加相关。心室功能障碍患者的半乳糖凝集素-3含量会升高，而且含量于心衰的严重程度直接相关。快速定量检测患者的半乳糖凝集素-3水平具有重大的临床意义。
[0003]免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0004]目前，检测半乳糖凝集素-3(Gal-3)的方法目前主要是酶联免疫技术(ELISA)，ELISA技术存在以下缺点:检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好；检测时间长。因此酶联免疫技术检测半乳糖凝集素-3不适合临床快速诊断。鉴于目前尚无快速的定量检测方法，本发明的目的是提供一种可用于快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸以及一种可用于快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸盒，所述胶体金试纸和胶体金试纸盒具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸，本发明所述的半乳糖凝集素-3的胶体金试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。
[0006]本发明的技术方案是:[0007]—种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸，包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位检测线8包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的Gal_3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
[0008]优选地,所述控制线9包被有抗DNP抗体,所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。BSA是牛血清白蛋白。
[0009]优选地，所述第一固定部件7为双面胶，第二固定部件6为单面胶。
[0010]优选地，所述两条控制线9与检测线8为平行设置。
[0011]本发明的另一个目的是提供了一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸盒，在本发明所述的定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸的基础上还包括一外壳10。
[0012]所述外壳优选塑料外壳。
[0013]所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜I上的检测线8和两条控制线9、以及吸水垫4。
[0014]本发明所述的试纸盒具有方便携带和贮存的优点。
[0015]本发明的又一个目的是提供本发明所述的胶体金试纸在检测半乳糖凝集素-3中的应用。
[0016]本发明的再一个目的是提供一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的方法，包括使用权利要求1所述胶体金试纸来快速定量检测半乳糖凝集素-3的步骤。
[0017]本发明所述的快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸或试纸盒的工作原理是:采用双向侧流免疫反应原理,通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的Gal-3抗原首先与偶合垫上的抗Gal-3抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着样本在硝基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区(Gal-3检测线)时，与预先包被在硝基纤维素膜上的抗GAL-3抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测线上。血液中的GAL-3越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检测过程中，控制线偶合物(即DNP-BSA标记的胶体金)，也会随样本在硝基纤维素膜上层析，当层析至硝基纤维素膜的控制线时，DNP-BSA胶体金会与预先包被在硝基纤维素膜上的抗DNP抗体发生反应从而被固定在对照区(控制线)上。由于胶体金为红色，因而固定在硝基纤维素膜控制线上的抗DNP中的DNP-BSA胶体金免疫复合物将显示红色。当样本中不含GAL-3时，则只显示两条控制线。当样本含GAL-3时，检测线就会清晰的显示出来。
[0018]当反应结束后，利用多功能免疫检测仪(瑞莱生物工程(深圳)有限公司)将控制线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值(RI)0然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对GAL-3的浓度进行计算并显示结果，以ng/mL为单位表示。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明所述快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸的一种优选实施方式的结构示意图。
[0020]其中，1:硝酸纤维素膜，2:偶合物垫片，3:样本垫片，4:吸水垫，5:支撑垫片，6:单面胶，7:双面胶，8:检测线，9:控制线。
[0021]图2是本发明所述快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸盒的一种优选实施方式的示图。
[0022]其中，3:样本垫片，8:检测线，9:控制线，4:吸水垫，10:外壳。
[0023]实施方式
[0024]以下结合附图对本发明所述快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸或试纸盒进行详细说明，不能理解为是对本发明的限制。以下实施例中所使用的材料和试剂除特别说明外，均为普通市售。
[0025]【实施例1】制备快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸
[0026]如图1所示的胶体金试纸结构，包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜I的一端上方层叠连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7，上方粘接单面胶6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位检测线8包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
[0027]所述控制线9包被有抗DNP抗体,所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
[0028]其中，硝酸纤维`素膜I在胶体金试纸中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线8是将Gal-3抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0.5mg/ml的浓度，取lul/cm划线于所述硝酸纤维素膜I上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制线9是将抗DNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0.5mg/ml的浓度,取lul/cm划线于所述硝酸纤维素膜I上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0029]其中，所述偶合物垫片2的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液(包含0.1-1%的酪蛋白，0.5-5%的牛血清白蛋白、
0.005-0.5%的硼酸、0.01-0.2%的PEG)中浸泡5分钟后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜仪器将金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物涂布在偶合物垫片2上，涂布量是lul/mm，干燥，即得。优选地，所述偶合物垫片2的预封闭缓冲液包含0.8%的酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0.007%的硼酸，0.1%的PEG。
[0030]其中，所述样本垫片3可对液态样品起到初步过滤作用。将样本垫片用141封闭液(包含:0.1-1%的Tris,0.1-1%的Tween20,0.1-1%的酪蛋白，0.05-0.5%的鼠抗人红细胞)浸泡5分钟后，过夜37°C干燥，即得。优选地，所述141封闭液包含:0.3%的Tris，0.8%的酪蛋白，0.3%的鼠抗人红细胞。
[0031]将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片5上，获得快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸。
[0032]【实施例2】用本发明所述胶体金试纸快速定量检测半乳糖凝集素-3。
[0033]取本发明优选的一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸，如图1所示，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜I的一端上方层叠连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7，上方粘接单面胶6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位检测线8包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。按以下步骤进行检测:1)抽取的病人血清、血浆或全血等待检样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳)有限公司)中判定结果。
[0034]【实施例3】用本发明所述胶体金试纸盒快速定量检测半乳糖凝集素-3。
[0035]取本发明优选的一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸盒，如图1和图
2所示，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7，上方粘接单面胶6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位检测线8包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体,所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。所述胶体金试纸还包括一外壳10，所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜I上的检测线8和两条控制线9、以及吸水垫4。按以下步骤进行检测:1)抽取的病人血清、血浆或全血等待检样本，如低温保存样本 需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳)有限公司)中判定结果。
【权利要求】
1.一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸，包括支撑垫片(5)，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜(1)，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫(4)，另一端连接偶合物垫片(2)，所述偶合物垫片连接样本垫片(3)，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件(7)，上方设有第二固定部件(6)，其特征在于，所述硝酸纤维素膜(I)中间部位检测线(8)包被有Gal-3抗体，检测线两边分别设有控制线(9)，所述偶合物垫片(2)上涂布有金标记的Gal-3单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
2.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述控制线(9)包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
3.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述第一固定部件(7)为双面胶，第二固定部件(6)为单面胶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的胶体金试纸，其特征在于，所述胶体金试纸外还包括一外壳(10),所述外壳包裹所述胶体金试纸外,露出样本垫片(3)、硝酸纤维素膜(I)上的检测线(8)和两条控制线(9)、以及吸水垫(4)。
5.如权利要求4所述的胶体金试纸，其特征在于，所述两条控制线(9)与检测线(8)为平行设置。
6.如权利要求1所述的胶体金试纸在检测半乳糖凝集素-3中的应用。
7.一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述胶体金试纸来快速定量检测半乳糖凝集素-3的步骤。
【文档编号】G01N33/68GK103869079SQ201410080580
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】刘红剑, 赵俊平, 吴伟云, 夏宣喜 申请人:瑞莱生物工程（深圳）有限公司