一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法。本发明的样品前处理是用甲醇水溶液提取食品样品中的百草枯和敌草快，并选择C18和PSA分散固相萃取剂对提取液进行净化，最后结合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱，通过化合物离子的精确质量数实现食品中残留百草枯和敌草快的定性和定量测定。百草枯的平均回收率80.6%～96.8%，相对标准偏差为3.9%～7.1%，定量限10μg/kg；敌草快的回收率80.8%～97.3%，相对标准偏差为3.5%～7.8%，定量限10μg/kg。本发明能有效降低食品中百草枯和敌草快残留检测中的基质干扰，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有QuEChERS方法的补充和改进。
【专利说明】一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农药残留量的测定【技术领域】，具体地说涉及一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法。
【背景技术】
[0002]在水果、蔬菜、粮谷等农作物种植过程中，农田杂草对农作物产量和品质产生重要影响。除草剂在农业生产中的使用，不仅节省了大量繁重的除草体力劳动和机械除草作业，更重要的是减少了因草害造成的农产品产量和品质的损失，得到可观的经济效益。但是随着人们对食品安全问题的关注，除草剂残留对人类健康的危害也倍受关注。
[0003]百草枯(paraquat)化学名1，1，- 二甲基_4，4，-联吡啶阳离子，属于有机杂环类季铵盐除草剂。作为广谱性除草剂应用广泛，2011年百草枯销售额在全球除草剂销售中排名第2。百草枯对人畜具有较强的毒性作用，摄入后对生物体的还原-氧化活性影响很大，对肺、心、肝、肾等都有害，目前百草枯中毒尚无有效治疗方法。我国、国际食品法典委员会(CAC)、美国、欧盟和日本等国家对百草枯均制定了残留限量标准，在水果、蔬菜、鱼、肉等多种食品中的最大残留限量0.01?3.5mg/kg。
[0004]敌草快(diquat)化学名1，1，_乙撑_4，4，_联吡啶阳离子属于有机杂环类非选择性除草剂。用于马铃薯、棉花、大豆、玉米、高粱、亚麻、向日葵等作物催枯，当作物成熟时残余绿色部分和杂草迅速枯干，可以提早收割；用于农田杂草防除:夏玉米免耕除草、果园杂草生长旺盛期进行杂草叶面处理。敌草快对属于中等毒性除草剂，对皮肤和眼睛有刺激作用。我国、美国、欧盟和日本等国家对敌草快均制定了残留限量标准，在水果、蔬菜、鱼、肉等多种食品中的最大残留限量0.05?2mg/kg。
[0005]QuEChERS方法作为新发展起来的样品前处理技术，是代表快速、简单、价廉、高效、稳定和安全(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)的样品前处理方法。具有回收率高，分析农药范围广，处理速度快，溶剂使用量少，操作简便等优点。目前国际广泛认可使用的QuEChERS方法有欧盟制定的EN15662和美国官方分析化学师协会的A0AC2007.01标准方法。2个方法都包括提取、净化2个步骤:1用乙腈或含1%乙酸的乙腈提取样品，通过加入缓冲盐混合物进行盐析萃取实现乙腈和样品所在水相的液-液分离；2用分散固相萃取剂和无水硫酸镁对提取溶液净化，分散固相萃取剂依据样品基质和待测化合物的性质，可选择PSA、GCB、C18EC等。但都必须加入无水硫酸镁以除去中乙腈中残留的水分。
[0006]但是百草枯和敌草快属于强极性季铵盐类化合物，极易溶于用水，难以用乙腈从水相中萃取，因此无法采用现有QuEChERS方法进行样品前处理。通常百草枯及敌草快前处理采用固相萃取柱净化，方法较复杂，回收率低，对操作人员要求较高；或不经净化直接检测，基质干扰大，对仪器污染严重。因此寻求和建立适应百草枯和敌草快残留检测的QuEChERS前处理方法是非常必要的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，以弥补现有技术的不足。
[0008]本发明的另一目的是提供一种样品前处理方法，以弥补现有国际广泛认可使用的QuEChERS方法无法用于百草枯和敌草快残留检测的不足。
[0009]本发明的样品前处理是对已有QuEChERS方法的补充和改进，由于百草枯和敌草快极易溶于水的特性，现有QuEChERS方法用乙腈或含I %乙酸的乙腈从水相中盐析萃取的提取方法无法实用，本发明选用甲醇水溶液为提取溶剂从样品中直接提取，保证了百草枯的提取效率。在净化步骤，因为提取溶剂主要是水，所以现有方法加入无水硫酸镁除以去除提取液中残余水分的方法并不可行，因此本发明仅使用分散固相萃取剂对提取液进行净化，而不加入无水硫酸镁，且分散固相萃取剂只能选择C18和PSA。
[0010]因此，本发明的检测，其前处理是首先用甲醇水溶液提取食品样品中的百草枯和敌草快，再选择C18和PSA分散固相萃取剂对提取液进行净化，最后结合高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(LC-Q T0F)，通过化合物离子的精确质量数实现准确定性和定量分析，以弥补现有技术中对百草枯和敌草快残留检测无法使用QuEChERS方法前处理的技术缺陷，达到提高LC-Q TOF检测的灵敏度，实现食品中百草枯残留的准确分析。
[0011]本发明的测定方法包括如下步骤:
[0012](I)提取
[0013]称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液涡旋振荡，离心；
[0014](2)净化
[0015]移取(I)获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22 μ m滤膜，所得样品液待测定；
[0016](3)配制基质标准工作溶液
[0017]将空白样品按上述步骤(I)、(2)处理，用该空白样品基质溶液在10?1000 μ g/L范围内配制百草枯和敌草快系列浓度标准工作液；
[0018](4)液相色谱一四极杆飞行时间串联质谱(LC-Q T0F)测定
[0019]a)定量测定:将步骤(3)中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中目标化合物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标化合物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标化合物残留量。
[0020]b)定性测定:检测步骤(2)得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含目标化合物。
[0021]上述步骤(2)中优选甲醇水溶液的体积浓度是20%。。
[0022]上述步骤(2)中基质分散固相萃取剂由C18和PSA组成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分别为50mg。
[0023]上述步骤(4)中液相色谱的流动相为A:甲醇和流动相B:含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水溶液，采用A:B体积比20:80等度洗脱，流速:0.2mL/min。[0024]上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱(HILIC)。
[0025]上述步骤(4)中质谱检测使用电喷雾源(ESI)正离子模式，毛细管电压为+4000V，雾化气压力为275.8kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350°C，干燥气流速为10.0L/min，参比离子 m/zl21.050873 与 m/z922.009798，扫描范围 50_1100m/z。
[0026]上述步骤(4)中质谱检测使用一级全扫描模式，百草枯准分子离子的准确分子量186.1159，敌草快准分子离子的准确分子量184.3322。
[0027]上述步骤(I)和(2)中的涡旋振荡时间是lmin。
[0028]上述步骤(I)和(2)中的离心5000r/min,离心时间3?5min。
[0029]上述步骤(I)?(4)中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。
[0030]本发明的有益效果在于:
[0031]本发明能有效降低食品中百草枯和敌草快残留检测中的基质干扰，将此前处理方法结合HPLC-Q TOF应用于食品中百草枯和敌草快定性确证和定量检测，百草枯平均回收率80.6%?96.8%,相对标准偏差(RSD)为3.9%?7.1% ;敌草快的回收率80.8%?97.3%,相对标准偏差(RSD)为3.5%?7.8%。本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有QuEChERS方法的补充和改进。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为10ng/mL基质标准百草枯提取离子色谱图。
[0033]图2百草枯标准质谱图。
[0034]图3为10ng/mL基质标准敌草快提取离子色谱图。
[0035]图4敌草快标准质谱图。
【具体实施方式】
[0036]现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。
[0037]本发明实施例中使用的仪器与试剂:
[0038]T18Basic 均质器(IKA, Germany) ;CR21G III型高速冷冻离心机(Hitachi, Japan)；MS3型旋涡混合器(IKA, Germany) ; 1200高效液相色谱-6520四级杆飞行时间质谱(Agilent, USA) ；PSA 分散固相萃取剂(Agilent，USA)；C18 分散固相萃取剂(Agilent，USA)。
[0039]试剂:甲醇(HPLC级,Merke, Germany )；甲酸铵(HPLC 级，CNW, Germany );甲酸(HPLC级，CNW, Germany)。
[0040]标准物质:百草枯纯度为97.5%，敌草快纯度为99.0%，均购自德国DrEhrenstorfer 公司。
[0041]实施例1:苹果中百草枯和敌草快残留量的检测
[0042](I)样品前处理
[0043]称取均质化的苹果样品10.0g于50mL具塞塑料离心管中，加入IOmL甲醇水溶液，润旋lmin, 5000r/min离心5min。离心后,取2mL上清提取液至装有IOOmg C18和IOOmg PSA的离心管中，润旋lmin, 5000r/min离心3min。取上清液过0.22 μ m滤膜后,所得样品液供液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(LC-Q TOF)测定。
[0044](2)标准工作溶液的配制
[0045]分别称取25±0.1mg百草枯、敌草快标准品于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得其标准储备液浓度1000.0 μ g/mL ;分别移取百草枯和敌草快标准储备液各1.0mL置于IOOmL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0 μ g/mL混合标准中间液；
[0046]用经检测不含百草枯和敌草快的苹果作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成10、20、50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液。
[0047](3)液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(LC-Q T0F)测定
[0048]定量测定:将步骤(3)中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中目标化合物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标化合物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标化合物残留量。
[0049]其中色谱条件为HILIC色谱柱(2.1mmX 100mm, 1.7 μ m;美国Waters);流动相:甲醇和含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水，以体积比20:80等度洗脱；流速:0.2mL/min ；柱温:30°C ;进样量:2yL0
[0050]其中质谱参数为:电喷雾源(ESI)正离子模式扫描；干燥气温度350°C，干燥气流速10L/min，雾化气压力275 .8kPa，毛细管电压4kV，毛细管出口电压190V，扫描方式:一级全扫描，参比离子 m/zl21.050873 与 m/z922.009798，扫描范围 50_1100m/z。
[0051]定性鉴定:检测步骤(2)得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含目标化合物。
[0052]标准工作曲线和检出限:
[0053]以基质标准工作溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。以3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标化合物浓度作为检出限(L0D)，10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标化合物浓度作为定量限(L0Q)，获得各目标化合物的检出限和定量限。结果见表1。
[0054]表1百草枯的保留时间、回归方程、相关系数、定量限和检出限
[0055]
I保留时间(min) I回归方程I相关系数I定量限Ug/kg) I检出限(ug/kg)
百草枯 3.65Y=11019.1307Χ-44748.6835 0.9990 105
敌草快 3.85Υ=5822.0997Χ-45428.5839 0.9992 105
[0056]加标回收率和重复性:
[0057]用经检测不含百草枯的苹果作为空白样品，加入低中高不同浓度水平的百草枯和敌草快混合标准溶液，添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，在3个加标水平上，百草枯的回收率为80.6%?96.8%,相对标准偏差(RSD)为3.9%?7.1%，敌草快的回收率80.8%?97.3%,相对标准偏差(RSD)为3.5%?7.8%。说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
[0058]以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求。
【权利要求】
1.一种食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征在于包括如下步骤: (1)提取 称取均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液涡旋振荡，离心； (2)净化 移取上述步骤(1)获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22 μ m滤膜，所得样品液待测定； (3)配制基质标准工作溶液 将空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，用该空白样品基质溶液在10~1000 μ g/L范围内配制百草枯和敌草快系列浓度标准工作液； (4)液相色谱一四极杆飞行时间串联质谱测定 a)定量测定:将步骤(3)中的各浓度基质标准工作液进行LC-QTOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中百草枯和敌草快的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中百草枯和敌草快含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百草枯和敌草快残留量； b)定性测定:检测步骤(2)得到的样品液中目标化合物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标化合物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含目标化合物。
2.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(2)中甲醇水溶液的体积浓度为20%。
3.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(2)中基质分散固相萃取剂由C18和PSA组成，每毫升提取液中C18和PSA加入量分别为50mgo
4.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(4)中液相色谱的流动相为A:甲醇和流动相B:含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水溶液，采用A:B体积比20:80等度洗脱，流速:0.2mL/min。
5.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(4)中液相色谱的色谱柱为亲水色谱柱。
6.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(4)中质谱检测使用电喷雾源正离子模式，毛细管电压为+4000V，雾化气压力为275.8kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350°C，干燥气流速为10.0L/min，参比离子m/zl21.050873与m/z922.009798，扫描范围 50_1100m/z。
7.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(4)中质谱检测使用一级全扫描模式，百草枯准分子离子的准确分子量186.1159，敌草快准分子尚子的准确分子量184.3322。
8.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤(I)和(2)中的润旋振汤时间是1min。
9.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤(1)和(2)中的离心5000r/min,离心时间3~5min。
10.如权利要求1所述的食品中百草枯和敌草快残留量的测定方法，其特征是上述步骤（I)~（4)中样品接触到的包`括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。
【文档编号】G01N30/06GK103822994SQ201410096085
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】刘靖靖, 王境堂, 吴振兴 申请人:刘靖靖