2,4-二氯苯氧乙酸酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测食品中2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）含量的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒包括：96孔酶标板，2,4-D9个浓度的标准品溶液、高浓度标准品溶液、高浓度的2,4-D单抗溶液、高浓度的酶标2,4-D溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液、浓缩洗涤液、盖模板、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被羊抗鼠二抗，与工作浓度的2,4-D单克隆抗体结合之后，样本中含有的2,4-D和酶标2,4-D抗原共同竞争2,4-D单克隆抗体上的有限位点，反应达到平衡后用底物显色，样本吸光度与标准曲线比较对应的值，反对数后再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中2,4-D的含量。
【专利说明】2, 4- 二氯苯氧乙酸酶联免疫检测试剂盒
一、【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫检测试剂盒。
二、技术背景:
[0002]俗话说:“民以食为天”，食品安全问题是关系千千万万人民群众切身利益和国计民生的大问题。但是随着畜牧业的现代化和高科技，食品安全问题日益严峻，令人心惊胆战。为了除草和虫害，有人大量使用有毒，甚至剧毒农药，致使蔬菜、果品农药残留严重超标，对人的身体健康和生命健康构成严重的威胁。如2，4- 二氯苯氧乙酸是一种世界广泛使用的除草剂也是一种人工合成的植物激素具有与生长素相似得生理效应。它可以通过我们的皮肤和呼吸系统进入体内，具有潜在的致癌性和致突变性，能刺激人体分泌大量的雌性激素，干扰内分泌系统，对生殖和免疫系统会产生很不良的影响。除此之外，2，4-二氯苯氧乙酸还能使血红细胞聚集，阻碍红细胞的携氧能力，损伤肌肉、肾脏、肝脏和脑组织。鉴于2，4-二氯苯氧乙酸对人类健康和生态环境造成的危害，许多国家都制订了该农药在农产品中的最高残留限量，我国2001年新颁布的《饮用水水质卫生规范》将2，4- 二氯苯氧乙酸的极限值规定为0.03mg/L。世界卫生组织2003年8月颁布的《饮用水水质指南》规定饮用水中2，4- 二氯苯氧乙酸的最大检出浓度为30 μ g/L。充分认识2，4- 二氯苯氧乙酸的性质，研究出快速方便的检测方法、建立有效的监控体系和控制标准是十分必要的。
[0003]目前，2，4-二氯苯氧乙酸残留的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、联用技术等。色谱法具有分离速度快、检测效率高、重现性好、灵敏度高等显著优点，但由于前处理比较复杂、仪器昂贵、技术难度大、检测费用高而且需要专业的技术人员等不足，较适合于确证使用，难以应对大批量样品的检测，大大限制了其广泛应用。因此要研制特异、敏感、快速、简便的2，4- 二氯苯氧乙酸检测方法具有十分重要的意义。
三、
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的:提供一种检测方便快捷、成本低、灵敏度高、特异性好的检测工具，此种检测工具不需要专业人员操作，可快速准确检测样品的2，4-二氯苯氧乙酸含量，弥补了高效液相色谱检测的不足。
[0005]本发明的技术方案:2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫快速检测试剂盒，包括盒体、17个试剂瓶、I块酶标板，其中，塑料泡沫板设置在盒体内，塑料泡沫板上设有多个试剂瓶凹槽，多个试剂瓶下凹槽的高度是所对应的试剂瓶高度的1/3-3/4，各组试剂瓶放置在多个试剂瓶下的凹槽内。
[0006]上述一种2，4- 二氯苯氧乙酸酶联免疫快速检测试剂盒，包括盒体，17个试剂瓶，一块酶标板，一块盖模板，一个自封袋，一个放试剂瓶的下凹槽，一份说明书，一份质检报
生口 ο
[0007]其特征在于:96孔酶标板，上面包被有羊抗鼠二抗，可拆卸成12条酶标微孔条，可以一次测试多个样品，也可以拆开分次测试，剩余的酶标微孔条可以储存在自封袋内，下次使用；所述的试剂瓶分为八组:第一组试剂瓶是装有标准溶液的试剂瓶，共9瓶，第二组是装有高浓度标准品溶液的试剂瓶，共I瓶；第三组试剂瓶是装有酶标2，4- 二氯苯氧乙酸的试剂瓶，共I瓶；第四组试剂瓶为装有2，4- 二氯苯氧乙酸单抗浓缩液的试剂瓶，共I瓶，第五组试剂瓶是分别装有显色液A液和B液的试剂瓶，分别各I瓶，共2瓶；第六组试剂瓶是装有终止液的试剂瓶，共I瓶；第七组试剂瓶是装有样品稀释液的试剂瓶，共I瓶；第八组是浓缩洗涤液试剂瓶，共I瓶。用不同颜色的瓶盖和瓶体对试剂进一步加以区分。
[0008]上述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫快速检测试剂盒，其中八组试剂瓶分别为:标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶,酶标2，4- 二氯苯氧乙酸用红色帽的白色PE塑料瓶，2，4- 二氯苯氧乙酸单抗浓缩溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，凝缩洗涤液用透明帽的白色PE塑料瓶，抗体稀释液，用红色帽的白色PE塑料瓶。下凹瓶位由白色塑料泡沫制成。
[0009]根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的盒体为硬质盒体。
[0010]上述的2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其中，所述的多个试剂瓶下凹槽的大小与所对应的试剂瓶大小相匹配。
[0011]试剂瓶放在塑料泡沫凹槽内，和说明书、质检报告、盖模板、酶标板、自封袋一起封装在硬质盒内，便于携带和运输。
[0012]测试时，采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被羊抗鼠二抗，与工作浓度的2，4- 二氯苯氧乙酸单抗结合之后，样本中含有的2，4- 二氯苯氧乙酸和酶标2，4- 二氯苯氧乙酸抗原共同竞争2，4- 二氯苯氧乙酸单抗上的有限位点，反应达到平衡后用底物显色，样本吸光度与标准曲线比较对应的值，反对数后再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中2，4- 二氯苯氧乙酸的含量。
[0013]与现有的检测技术相比，本发明具有显著的优势:1)和高效液相色谱一质谱技术相比，本试剂盒成本低廉；2)与常规技术相比，本试剂盒不需要专门的熟练的操作人员，操作简单，方便；可满足不同层次人员需要，包括专业检验、海关检疫、卫生检疫、质量检测、力口工企业和养殖场户等，便于推广应用。3 )本试剂盒对样品的要求低，前处理简单，可广泛应用于各种食品检测；4)本试剂盒的原理是酶联免疫反应，因此，灵敏度较其他方法高，最低检测限达到0.659 μ g/L，回收率达到88 ±16%ο
四、【专利附图】
【附图说明】:
[0014]下面结合附图和具体试剂试试本发明的试剂盒做进一步的说明，但不构成本发明的任何限制。
[0015]图1是本发明酶联板横切示意图；
[0016]图2是本发明酶联板纵切示意图；
[0017]图3是本发明酶联板剖面示意图；
[0018]图4是本发明的酶联板的盖板示意图；
[0019]图5是本发明的试剂瓶的测视不意图；[0020]图6是本发明的泡沫模板的俯视示意图；
[0021]图7是本发明的试剂盒的打开示意图。
五、【具体实施方式】
[0022](一)样品的前处理
[0023]1.配制溶液:配制溶液1.0moI/L氢氧化钠溶液，称取4.0g的氢氧化钠，加蒸馏水溶解定容到100mL。
[0024]2.洗涤溶液:根据需要量，将25X浓缩洗涤溶液用蒸馏水按照1:24的体积比进行稀释，用于酶标板的洗涤。
[0025]以2，4-二氯苯氧乙酸为食品添加剂的样本处理步骤:食品样，称取10.0g样品，力口入 40mLPBS 和 5mLlmol/L NaOH 溶液，搅拌 30min，过滤，滤液用 lmol/L HCl 调 ρΗ7.2 ?7.4，处理后的溶液仍加热浓缩至IOmL ;饮用水样，一般可直接用于检测，若浑浊不清，可3000r/min离心IOmin或过滤，取上清液或滤液用于检测。
[0026](二)使用试剂盒操作步骤
[0027]1.将所需的试剂盒包括稀释液及洗涤液从冷藏的环境中取出，放置在室温(20-25°C) 30分钟以上，使其达到室温，在使用前将每种试剂摇匀。
[0028]2.取出酶标板架及需要数量的微孔，不需要的微孔放入自封袋，冷藏。
[0029]3.将浓缩2，4- 二氯苯氧乙酸单抗和浓缩酶标2，4_ 二氯苯氧乙酸用样品稀释液5倍稀释。
[0030]4.编号:将样本溶液和标准品工作溶液对应的微孔编号，每个样品溶液和标准品工作溶液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
[0031]5.加入稀释后的2，4-二氯苯氧乙酸单抗，每孔50yL，设阴性和空白对照，37°C中反应15分钟。
[0032]6.取出微孔板，甩出孔内溶液，用洗涤液洗涤3-4次，每次洗涤后用吸水纸拍干。
[0033]7.每孔加入酶标2，4- 二氯苯氧乙酸工作液50 μ L，同时等体积加入2，4_ 二氯苯氧乙酸标准品及样品溶液，盖上盖板膜置于37°C 30分钟，取出重复上述洗涤步骤。
[0034]8.将显色液A和B按体积1:1混合,每孔加50 μ L,室温显色5分钟。
[0035]9.每孔加入终止液50 μ L,用酶标仪于450nm处，测定每孔OD值(若无酶标液仪，则不加终止液用目测法可进行判定)
[0036](三)结果判定
[0037]结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。
[0038]注意样本吸光值与2，4- 二氯苯氧乙酸含量的关系。
[0039]1.目标判断法:根据样品和标准品的颜色的深浅来判断样品的浓度范围。标准品的颜色是按照浓度(O μ g/L, I μ g/L, 2 μ g/L, 4 μ g/L, 8 μ g/L, 16 μ g/L, 32 μ g/L, 64 μ g/L,128 μ g/L)的升高颜色依次变浅至无色，假如样品的颜色处于8 μ g/L, 16 μ g/L两孔颜色之间，那么样品的浓度就处于8 μ g/L, 16 μ g/L之间再乘以稀释倍数。
[0040]2.定量分析法:
[0041](I)制作标准曲线:
[0042]百分吸光率的计算，样品或者标准品的吸光值的百分率等于标准品或者样品的平均值除以第一个标准品(标准品浓度为O的孔)的吸光值，再乘以100%，即百分吸光度值(％)=Β/Β0Χ 100%，B为标准品或者样品对应孔的吸光值的平均值，BO为标准品浓度为O的孔的吸光值的平均值。
[0043]以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(O μ g/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线。将样本的百分吸光率带入标准曲线中，从标准曲线读出样本所对应的样品浓度的对数值，再反对数，得到浓度再乘以稀释倍数，得到样本中2，4-二氯苯氧乙酸的含量。
[0044](四)测定时注意事项:
[0045]1.测试前应将所用的试剂和样品回到常温(20_25°C)，否则导致OD值偏低。
[0046]2.洗涤过程中不可间断洗完拍完板应立即进行下一步试验，否则，出现半空干燥造成标准曲线不成线性，重复性差，测定结果不准确。
[0047]3.试剂混合要均匀，显色液B要加入到显色液A，充分混匀，否则标准曲线不成线性，重复性不好，影响测定结果。
[0048]4.终止液为2mol/L的硫酸溶液,避免接触皮肤。
[0049]5.储存条件:保存试剂盒应在0_8°C，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封，标准物质和无色发光剂对光敏感，因此避免直接暴漏在光线下。显色液若有任何颜色表明变质，不应再使用。O标准的吸光度应在I左右，小于0.5时，表示试剂可能变质。不要使用过了有效期的试剂盒，稀释与掺杂使用会引起实验结果不准确，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。
[0050]加A、B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30mino
[0051]该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或者过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【权利要求】
1.一种检测食品中2，4-二氯苯氧乙酸含量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜，17瓶试剂和放试剂的小凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于:酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被羊抗鼠二抗制成检测板，17瓶试剂分别为9瓶标准品溶液、I瓶高浓度标准品溶液、I瓶2，4- 二氯苯氧乙酸单抗浓缩溶液、I瓶高浓度酶标2，4- 二氯苯氧乙酸溶液、I瓶显色液A溶液、I瓶显色液B溶液、I瓶终止液、I瓶样品稀释溶液、I瓶浓缩洗涤溶液，下凹位共18个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝钼袋内；盖板膜是塑料硬模；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标2，4- 二氯苯氧乙酸用红色帽的白色PE塑料瓶，2，4- 二氯苯氧乙酸单抗浓缩溶液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的黑色塑料瓶，显色液B用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，样品稀释液用红色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的白色PE塑料瓶；下凹瓶位由白色塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述酶联板(2)是可拆的96孔酶联板，可拆卸为12条酶标反应微孔条，每个酶标反应微孔条有8个反应孔，酶联板的微孔上包被有羊抗鼠二抗制成包被板。
4.根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，盖板膜大小与酶标板大小相一致。
5.根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，标准品溶液共9瓶，ImL /瓶，浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0 Pg/L，高浓度标准品溶液(lmg/L)，I瓶，ImL ;2，4- 二氯苯氧乙酸单抗浓缩液I瓶，2mL ;高浓度酶标2，4- 二氯苯氧乙酸I瓶，2mL ;显色液A液I瓶，7mL ;显色液B液I瓶，7mL ;终止液I瓶，7mL ;样品稀释液I瓶，30mL ;浓缩洗涤液I瓶，30mL。
6.根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的盒体为硬质盒体。
7.根据权利要求1所述的一种2，4-二氯苯氧乙酸酶联免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的多个试剂瓶下凹槽的大小与所对应的试剂瓶大小相匹配。
【文档编号】G01N33/577GK103823067SQ201410098334
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】席俊, 龚芳, 史巧巧, 陆启玉, 职爱民, 杨艳艳 申请人:河南工业大学