一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法
【专利摘要】本发明涉及食品中有害成分的检测领域，特别涉及一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法：利用HClO4溶液对质量为m的待测食品进行生物胺的提取处理，得到体积为V的上清液；在上清液中加入等体积的正己烷溶液进行萃取，重复1-2次，弃去上层有机相部分，得到净化后的提取液；将净化后的提取液进行柱前衍生化，得到衍生化的提取液；采用超高效合相色谱仪检测衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的质量浓度。本发明采用超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量，并以超临界二氧化碳与正己烷/异丙醇/氨水溶液的混合体系为流动相，其黏度低，传质性能好，所以分析时间快、溶剂载量少、环境污染小。
【专利说明】一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品中有害成分的检测领域，具体而言，涉及一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法。
【背景技术】
[0002]生物胺是一类具有生物活性的含氮有机化合物的总称，可以看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。根据结构，可以将生物胺分成脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等?、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和杂环族(组胺、色胺等)三大类。生物胺参与机体正常代谢，是激素类、生物碱、核酸和蛋白质合成的重要前体物质，大多数具有强烈的生理活性，如促进生长、增强代谢活力和调节血压等。
[0003]生物胺主要由氨基酸脱羧作用形成，少部分通过醛或酮的胺化作用形成，各种动植物组织细胞中都含有少量的生物胺。作为食品新鲜度的重要指标，生物胺主要由分泌氨基酸脱羧酶的微生物代谢形成，尤其是蛋白质含量丰富的食品，如发酵香肠和鱼肉制品、奶酪、发酵豆制品和饮料(啤酒，苹果酒、葡萄酒等生物胺不仅是食物香气的重要来源，也是化亚硝基化合物合成的前体。当人体摄入过量生物胺时，极易引起神经系统和心血管系统损伤。
[0004]目前，食品中生物胺的测定方法较多，在灵敏度、精密度、特异性、检测成本和所耗时间等方面各有利弊。其中，毛细管电泳法(以幻具有无需衍生直接检测的优点，且具有较高的灵敏度，其分离速度快、仪器简单，但样品前处理有一定的局限，不能引入过多有机溶齐0，限制了液液萃取法的应用；酶生物传感器法，简便快速、检测限较低、特异性强，但目标酶筛选困难且容易失活，导致成本较高、重现性差；薄层色谱法(110成本低、操作简单、快速，但灵敏度稍低，只能用于生物胺定性与半定量测定；高效液相色谱(即仏)或气相色谱法(60)准确性好，分离度和灵敏度较高，但分析时间长、有机溶剂载量大，成本高。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，以解决上述的问题。
[0006]在本发明的实施例中提供了一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，包括以下步骤:
[0007]利用此104溶液对质量为III的待测食品进行生物胺的提取处理，得到体积为V的上清液；在所述上清液中加入等体积的正己烷溶液进行萃取，重复1-2次，弃去上层有机相部分，得到净化后的提取液；
[0008]将所述净化后的提取液进行柱前衍生化，得到衍生化的提取液；
[0009]采用超高效合相色谱仪检测所述衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的质量浓度；
[0010]所述超高效合相色谱仪的检测条件为:[0011]色谱柱的直径为3.0111111、柱长为100111111、填料粒径为1.8 4 III，填料为高强度硅胶颗粒；流动相为超临界二氧化碳与正己烷/异丙醇/氨水溶液的混合体系，正己烷:异丙醇:氨水的体积比为65-75:25-35:0.10-0.20 ；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为:0-0.2111111 为 96%-100%，0? 2-5.0-为 68%-72%，5.0-7.2-为96%-100% ；分析时间:6.5-8.5-；柱温:40-6000 ；进样量:0.5-10 9 1 ；流速:1.5-2.5^1/111111 ；检测波长为 25411111 ；
[0012]通过以下公式计算得到待测食品中生物胺的含量为:(质量浓度轉)加。
[0013]优选地，所述生物胺包括精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺中的一种或多种。
[0014]优选地，所述提取处理具体为:
[0015]取质量III为3.0-6.08的待测样品，加入1001的0.4^1/1的此104，旋涡振荡5-10111111,离心，收集上清液。
[0016]优选地，采用0.411101/1的此104提取待测食品中的生物胺两次，收集上清液。
[0017]优选地，将所述净化后的提取液用0.411101/1的此104定容至2501。
[0018]优选地，所述柱前衍生化处理方法具体为:
[0019]取所述净化后的提取液1.01111^211101/1氢氧化钠溶液200 9 1、饱和碳酸氢钠溶液300 11 1和1008/1111丹磺酰氯的丙酮溶液101，振荡混匀，于35-45避光反应40-50111111，每隔8-10111111振荡一次；
[0020]加入100^ 1的氨水终止反应`，室温下避光静置20-40111111，取乙腈定容至5.01111，振荡混匀，经0.22 9 ！！！滤膜过滤后供色谱分析。
[0021]优选地，所述超高效合相色谱仪检测时:所述进样量为5.04 1。
[0022]优选地，所述超高效合相色谱仪检测时:波长补偿范围为350-450111
[0023]优选地，所述超高效合相色谱仪检测时:备压为1800-22001)81。
[0024]本发明实施例提供的一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，采用超高效合相色谱法'脑1106⑶1^61^611(36。111~0胍1:081'叩117，)测定食品中生物胺含量，并以超临界二氧化碳与正己烷/异丙醇/氨水溶液的混合体系为流动相，其黏度低，传质性能好，所以分析时间快、溶剂载量少、环境污染小。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1示出了本发明实施例4中生物胺混标色谱图；
[0026]图2示出了本发明实施例4中鱼露样品中生物胺的色谱图。
【具体实施方式】
[0027]下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
[0028]本发明实施例中提供了一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，包括以下步骤:
[0029]利用此104溶液对质量为III的待测食品进行生物胺的提取处理，得到体积为V的上清液；在所述上清液中加入等体积的正己烷溶液进行萃取，重复1-2次，弃去上层有机相部分，得到净化后的提取液；超临界二氧化碳与正己烷/异丙醇/氨水子，所以分析时间快、溶剂载量少、环境污染
有生物胺种类均出峰，节约测定时间。设定忖目色谱仪检测时，流速为1.5-2.51111/111111,
〔，其中优选为25411111作为检测波长。优选01。对不同柱温进行考察，经过多次试验1分离效果最佳，灵敏度更高，优选地，柱温
腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺中的
口入101111的0.411101/1的此104，旋涡振荡:提取的更彻底，优选地，采用0.411101/1的述超高效合相色谱仪检测时:进样体积为5.09 1，该进样体积可以保证峰面积在比较合理的范围，避免超出仪器的检测范围内。
[0046]不同的备压进样，得到不同的色谱图，超高效合相色谱仪检测时，备压为1800-22001381范围得到的峰型分离度好。
[0047]波长的补偿是为了去除基线噪音干扰，设定不同的波长补偿范围，根据不同波长补偿范围观察得到的峰型，波长补偿范围为350-45011111时，得到的峰型对称性好、选择性强、干扰少。
[0048]实施例1
[0049](￡1)样品预处理:准确称取3.08待测样品，置于5001离心管中，加入1001此104溶液(0.411101/1),润旋振荡5111111，于4。0下3040X8离心10111111，滤纸过滤，收集上清液。沉淀物用(0.411101/1)溶液重复提取一次，合并上清液。
[0050](^)净化处理:取上述样品上清液，加入等体积正己烷溶液，涡旋振荡5-11，弃去上层有机相，收集含此104部分，重复进行两次，转移至251111棕色容量瓶，用0.411101/1的此104溶液定容到刻度。
[0051](0)柱前衍生化:取所述净化提取液1.01111211101/1氢氧化钠溶液200 9 1、饱和碳酸氢钠溶液300 ^ 1和10^/1111丹磺酰氯的丙酮溶液振荡混匀，于351避光反应40111111，每隔10111111振荡一次；加入100^1 1的氨水终止反应，室温下避光静置20111111，取乙腈定容至5.0“，振荡混匀，得到衍生化液；取适量衍生化液经0.22 0 滤膜过滤以用于超高效合相色谱分析。
[0052]((1)超高效合相色谱法条件为:色谱柱:…卯III ^？02！188 01888色谱柱，
3.0父100111111，1.811111 ；流动相:超临界二氧化碳与正己烷丨异丙醇丨氨水溶液的混合液，正己烷:异丙醇:氨水的体积比为65:25:0.1`0 ；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为:0-0.2111111为969(),0.2-5.0-为68%，5.0-7.2-为96% ；分析时间:8.5111111 ；检测波长:25411111,波长补偿范围 350-45011111 ；备压:2200^)81 ；流速:1.51111/111111,柱温40。。，进样体积:10.0卩1。
[0053](6)将步骤((1)测定数值与生物胺标准品线性回归方程对比，得到食品样品中不同生物胺种类的含量。
[0054]生物胺标准品线性回归方程:称取精胺，亚精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，组胺和酪胺各1001118放于1001111棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得浓度为1.01118/1111的生物胺标准品的单标储备液；取单标储备液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4001/1的此104稀释至刻度，即得生物胺标准品的混标储备液。分别取混标储备液，用
0.411101/1的抝104稀释为浓度为0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0^^/1111梯度的标准溶液，分别按步骤化)进行柱前衍生化，经0.22 9 0滤膜过滤后，取适量采用超高效合相色谱仪进行检测，超高效合相色谱法条件同步骤((1)；以峰面积-浓度作为线性回归，得到生物胺标准品的线性回归方程。
[0055]实施例2
[0056](￡1)样品预处理:准确称取4.58待测样品，置于5001离心管中，加入2001此104溶液(0.411101/1),润旋振荡7111111，于4。0下3040X8离心10111111，滤纸过滤，收集上清液。
[0057](^)净化处理:取上清液，加入等体积正己烷溶液，涡旋振荡301！！，弃去上层有机品线性回归方程对比，得到食品样品中不同
安，亚精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，组胺.411101/1的此104定容至刻度，即得浓度为?储备液各10.001于10001棕色容量瓶中，兰品的混标储备液。分别取混标储备液，用5.0,10.0,20.011 梯度的标准溶液，分丈滤后，取适量采用超高效合相色谱仪进行5积-浓度作为线性回归，得到生物胺标准
芦品，置于501111离心管中，加入101111 ！！0104丨离心10111111，滤纸过滤，收集上清液。沉
-次，合并上清液。
、等体积正己烷溶液，涡旋振荡801！！，弃去,转移至2501棕色容量瓶，用0.411101/1的温601，进样体积:0.5 9 1。
[0067](6)将步骤((1)测定数值与生物胺标准品线性回归方程对比，得到食品样品中不同生物胺种类的含量。
[0068]生物胺标准品线性回归方程:称取精胺，亚精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，组胺和酪胺各1001118放于1001111棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得浓度为
1.01118/1111的生物胺标准品的单标储备液；取单标储备液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4001/1的此104稀释至刻度，即得生物胺标准品的混标储备液。分别取混标储备液，用0.4001/1的抝104稀释为浓度为0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0^^/1111梯度的标准溶液，分别按步骤化)进行柱前衍生化，经0.22 9 ！！！滤膜过滤后，取适量采用超高效合相色谱仪进行检测，超高效合相色谱法条件同步骤((1)；以峰面积-浓度作为线性回归，得到生物胺标准品的线性回归方程。
[0069]实施例4
[0070](￡1)样品预处理:准确称取6.08市售鱼露样品，置于5001离心管中，加入1001此104溶液(0.41X101/0，润旋振荡5111111，于41下3040X8离心10111111，滤纸过滤，收集上清液。沉淀物用(0.411101/1)溶液重复提取一次，合并上清液。
[0071](^)净化处理:在上清液中加入等体积正己烷溶液，涡旋振荡501！！，弃去上层有机相，收集含此104部分，重复进行两次，转移至251111棕色容量瓶，用0.411101/1的此104溶液定容到刻度。
[0072](0)柱前衍生化:取所述净化提取液1.01111211101/1氢氧化钠溶液200 9 1、饱和碳酸氢钠溶液300^ 1和川呢/“丹磺酰氯的丙酮溶液振荡混匀，于401避光反应45111111，每隔10111111振荡一次；加`入100^1 1的氨水终止反应，室温下避光静置30111111，取乙腈定容至5“，振荡混匀，得到衍生化液；取适量衍生化液经0.22 9 0滤膜过滤以用于超高效合相色谱分析。
[0073]((1)超高效合相色谱法条件为:色谱柱:…卯III ^？02！188 01888色谱柱，
3.0父100111111，1.811111 ；流动相:超临界二氧化碳与正己烷丨异丙醇丨氨水溶液的混合液，正己烷:异丙醇:氨水的体积比为70:30:0.15 ；采用梯度洗脱，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为:0-0.2111111为98%，0.2-5.0-为70%，5.0-7.2-为98% ；分析时间:
7.5111111,检测波长:254咖，波长补偿范围 350-45011111 ；备压:20001)81 ；流速:2.01111/111111,柱温501，进样体积:10.0 9 1。
[0074](6)进样6次，将测定数值与生物胺标准品线性回归方程对比，得到食品样品中不同生物胺种类的含量。
[0075]生物胺标准品线性回归方程:生物胺的不同种类-精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺均购于011611110818 (0110118,，称取精胺，亚精胺，腐胺，尸胺，色胺，苯乙胺，组胺和酪胺各10008放于100“棕色容量瓶中，用0.4^1/1的此104定容至刻度，即得浓度为1.01118/1111的生物胺标准品的单标储备液；取单标储备液各10.01111于1001111棕色容量瓶中，0.4^1/1的！^104稀释至刻度，即得生物胺标准品的混标储备液。分别取混标储备液，用0.4001/1的此104稀释为浓度为0.5,1.0,2.0,5.0,10.0、20.0 ^邑/“梯度的标准溶液，分别按步骤化)进行柱前衍生化，经0.22 ^ 0滤膜过滤后，取适量采用超高效合相色谱仪进行检测，超高效合相色谱法条件同步骤((1)；各浓度分别进样6次，以其中一次的进样为例，以时间为横坐标，峰高为纵坐标，得到的色谱图如图1所示，其中，1~精胺，2-亚精胺，3-酪胺，4-色胺，5-腐胺，6-苯基乙胺,7-尸胺，8-组胺；记录数据，以浓度(0为横坐标，平均峰面积(八)为纵坐标得到线性回归方程，如表1所示。
[0076]表18种生物胺的线性回归方程及相关参数
[0077]
【权利要求】
1.一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: 利用此104溶液对质量为III的待测食品进行生物胺的提取处理，得到体积为V的上清液；在所述上清液中加入等体积的正己烷溶液进行萃取，重复1-2次，弃去上层有机相部分，得到净化后的提取液； 将所述净化后的提取液进行柱前衍生化，得到衍生化的提取液； 采用超高效合相色谱仪检测所述衍生化的提取液中生物胺的含量，得到提取液中所含生物胺的质量浓度； 所述超高效合相色谱仪的检测条件为: 色谱柱的直径为3.0皿、柱长为100皿、填料粒径为1.8 ^ 111，填料为高强度硅胶颗粒；流动相为超临界二氧化碳与正己烷/异丙醇/氨水溶液的混合体系，正己烷:异丙醇:氨水的体积比为65-75:25-35:0.10-0.20 ；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为:0-0.2111111 为 96%-100%，0.2-5.0111111 为 68%-72%，5.0-7.2111111 为 96%-100% ；分析时间:6.5-8.5111111 ；柱温:40-60。。；进样量:0.5-10 11 1 ；流速:1.5-2.51111/111111 ；检测波长为254鹽； 通过以下公式计算得到待测食品中生物胺的含量为:(质量浓度轉)加。
2.根据权利要 求1所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述生物胺包括精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述提取处理具体为: 取质量III为3.0-6.08的待测样品，加入101111的0.4^1/1的!^104，旋涡振荡5-10—，离心，收集上清液。
4.根据权利要求3所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，采用0.4001/1的此104提取待测食品中的生物胺两次，收集上清液。
5.根据权利要求4所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，将所述净化后的提取液用0.411101/1的此104定容至2501。
6.根据权利要求5所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述柱前衍生化处理方法具体为: 取所述净化后的提取液1.01111211101/1氢氧化钠溶液2000 1、饱和碳酸氢钠溶液300 11 1和1008/1111丹磺酰氯的丙酮溶液101，振荡混匀，于35-451^避光反应40-50111111，每隔8-10111111振荡一次； 加入100^ 1的氨水终止反应，室温下避光静置20-40-11,取乙腈定容至5.0“，振荡混匀，经0.22 9 ！！！滤膜过滤后供色谱分析。
7.根据权利要求6所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪检测时:所述进样量为5.1。
8.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪检测时:波长补偿范围为350-450！^。
9.根据权利要求1所述的超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪检测时:备压为1800-22001)81。
【文档编号】G01N30/88GK103837635SQ201410120955
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】龚霄, 齐宁利, 陈珂, 林丽静, 李积华 申请人:中国热带农业科学院农产品加工研究所