一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法，其中，包括：试剂一，按质量体积比，其为包含1.5%~2%聚乙二醇的磷酸盐缓冲液，试剂一的pH值为7.38~7.42；试剂二，按质量体积比，其为浓度为0.02%~0.04%的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒；无乳链球菌标准品；按体积比，试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.5：1~3：1。本发明的试剂盒以及检测方法建立在抗原抗体结合的基础上，通过无乳链球菌单克隆抗体与乳胶偶联，并调节试剂一与试剂二在反应体系中的添加比例，实现无乳链球菌快速、高灵敏度的检测，本发明操作简便、快速，结果易于判断，无人为误差因素的影响。
【专利说明】一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测试剂领域，尤其涉及一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]无乳链球菌，又被称为B群链球菌，通常定殖在健康成人的肠道和尿道以及健康女性的生殖道。无乳链球菌是引起新生儿败血症和脑膜炎，以及引起产后感染的主要病原菌。非孕期成年人在免疫力低下或应用抗生素时，易引起生殖道微生态失调，导致感染的发生，更可通过垂直传播或上行感染引起新生儿败血症和脑膜炎。
[0003]新生儿的无乳链球菌感染临床进展迅速，具有发病迅速、病死率高的特点，是新生儿的主要死亡原因，已引起世界范围内广大学者的深切关注。细菌培养是检测无乳链球菌的标准方法，但无乳链球菌营养要求较高，培养鉴定耗时较长(至少3天)且阳性率较低。如何在感染早期快速、准确、灵敏地检测B群链球菌成为研究的热点。
[0004]无乳链球菌实验室检测包括细菌培养检测、血清学方法检测和分子生物学方法检测。细菌培养耗时长，阳性率低，对无乳链球菌感染早期快速筛查有一定的局限性；血清学检测方法方便、快捷，但不能完全排除假阴性结果；分子生物学检测，实验条件要求高，容易受到种种检测条件的影响，难以普及推广。
[0005]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法，旨在解决现有的检测方法耗时长、阳性率低、条件高、易受人为误差因素影响的问题。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其中，包括:
试剂一，按质量体积比，其为包含1.5%~2%聚乙二醇的磷酸盐缓冲液，试剂一的pH值为7.38^7.42 ；
试剂二，按质量体积比，其为浓度为0.02%~0.04%的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒；
无乳链球菌标准品；
按体积比，试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.5:1-3:1。
[0008]所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其中，按质量体积比，所述的磷酸盐缓冲液含2%聚乙二醇。
[0009]所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其中，所述的试剂一，其pH值为7.42。
[0010]所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其中，还包括一对照用无乳链球菌异常血清。
[0011]所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其中，试剂一与试剂二在反应体系中加入比率为3: 1。
[0012]一种应用如权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒的检测方法，其中，包括步骤:
A、在试剂一中加入无乳链球菌试验品，置于36.5 V~37.5°C孵育3~5min,然后加入试剂二，置于36.5°C ^37.5°C孵育，使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 5~15秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO，3飞分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al,得出Δ A试验品=Al-AO ；
B、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度和无乳链球菌标准品浓度Sia计算无乳链球囷试验品浓度S验；计算公式为:Stl^= S标准X ΔΑ试验品/ Δ A标准。
[0013]所述的检测方法,其中，所述的无乳链球菌试验品浓度在10ng/ml至300ng/ml。
[0014]有益效果:本发明的试剂盒以及检测方法建立在抗原抗体结合的基础上，通过无乳链球菌单克隆抗体与乳胶偶联，并调节试剂一与试剂二在反应体系中的添加比例，实现无乳链球菌快速、高灵敏度的检测，本发明操作简便、快速，结果易于判断，无人为误差因素的影响。
具体实施 方式
[0015]本发明提供一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒及其检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0016]本发明所提供的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其包括:
试剂一，按质量体积比，其为包含1.5%~2%聚乙二醇的磷酸盐缓冲液，试剂一的pH值为
7.38^7.42 ；
试剂二，按质量体积比，其为浓度为0.02%~0.04%的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒；
无乳链球菌标准品；
试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.5:1~3:1。
[0017]其中，上述质量体积比为w/v，即指100mL中含有多少g，例如试剂一中，100mL磷酸缓冲液中含有1.5~2g聚乙二醇。较佳的是，所述的磷酸盐缓冲液含2%聚乙二醇。
[0018]其中的无乳链球菌标准品是指已知570nm处吸光度以及浓度的标准品。
[0019]优选的，所述的磷酸盐缓冲液，其pH值为7.42。
[0020]试剂一与试剂二在反应体系中加入比率优选为3: 1，通过优化其加入比例，实现无乳链球菌快速、高灵敏度检测。
[0021]进一步，所述试剂盒还包括一对照用无乳链球菌异常血清，此对照用无乳链球菌异常血清可用于检验标准品的浓度的准确性，以对试验品进行质量控制。
[0022]基于上述试剂盒，本发明还提供一种应用如上所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒的检测方法，其包括步骤: 51、在试剂一中加入无乳链球菌试验品(即需检测浓度的样本)，置于36.50C?37.5°C孵育3?5min,然后加入试剂二,置于36.5V "37.5°C孵育,使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 5?15秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度A0，3飞分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A试验品=Al-AO ；
52、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度ΛA和无乳链球菌标准品浓度S计算无乳链球囷试验品浓度S验；计算公式为:Sti9s= S标准X Δ Ati9AB / Δ A标准。
[0023]较佳的，所述的无乳链球菌试验品浓度在10ng/ml至300ng/ml。
[0024]本发明通过乳胶偶联鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体，制成鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒，可提高免疫比浊反应的灵敏度，对试剂一的磷酸盐缓冲液进行优化，从而提供合适的抗原抗体反应PH环境，促进抗原抗体结合速率，并在试剂一中加入合适浓度的增浊剂聚乙二醇，提高了抗原抗体的反应浊度。通过对上述反应条件的建立及优化，使本发明能够高灵敏、快速检测样本中的无乳链球菌。
[0025]下面提供具体实施例来对本发明进行具体说明。
[0026]实施例一
S1、在试剂一中加入无乳链球菌试验品，置于37°C孵育3分钟,然后加入试剂二,置于37°C孵育，使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 10秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO’ 3分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A试验品=Al-AO ；
例如在300微升试剂一(含2%聚乙二醇的pH值为7.42的磷酸盐缓冲液)中加入10微升的无乳链球菌试验品，置于37°C孵育3min，加入100微升试剂二(鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒)，10秒后读取吸光度A0，3分钟后，读取吸光度Al，Λ A试验品=Al-AO(下述实施例方法相同)。
[0027]S2、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度Λ Aigm和无乳链球菌标准品浓度计算无乳链球菌试验品浓度;公式为:无乳链球菌试验品浓度Sa9i= SimX AkimpJAk
标准；
其中，所述的无乳链球菌试验品浓度在10ng/ml ;按体积比,试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为3:1 ;所述的试剂一，其pH值为7.42 ;按质量体积比，磷酸盐缓冲液中含有2%聚乙二醇；按质量体积比，鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒浓度为0.02%。
[0028]实施例二
51、在试剂一中加入无乳链球菌试验品，置于36.5°C孵育5分钟,然后加入试剂二,置于37.5°C孵育，使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 5秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO’ 5分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A试验品=Al-AO ；
52、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度ΛA和无乳链球菌标准品浓度S计算无乳链球菌试验品浓度S试验；公式为:无乳链球菌试验品浓度Sm= S标准X Δ Aii验品/ Λ A标
准； 其中，所述的无乳链球菌试验品浓度在150ng/ml ;按体积比,试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.5:1 ;所述的试剂一，其pH值为7.38 ;按质量体积比，磷酸盐缓冲液中含有1.8%聚乙二醇；按质量体积比，鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒浓度为0.03%。
[0029]实施例三
51、在试剂一中加入无乳链球菌试验品，置于37.5°C孵育4分钟,然后加入试剂二,置于36.5°C孵育,使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 15秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度A0，4分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al，得出Λ A试验品=Al-AO ；
52、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度ΛA和无乳链球菌标准品浓度S计算无乳链球菌试验品浓度S试验；公式为:无乳链球菌试验品浓度Sm= S标准X Δ Aii验品/ Λ A标
准；
其中，所述的无乳链球菌试验品浓度在300ng/ml ;按体积比，试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.8:1 ;所述的试剂一，其pH值为7.40 ;按质量体积比，磷酸盐缓冲液中含有1.5%聚乙二醇；按质量体积比，鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒浓度为0.04%。
[0030]通过对上述实施例分析可知，本发明的无乳链球菌检测方法，具有快速、高灵敏度的特点，并且操作简便、快速，结果易于判断，无人为误差因素的影响。
[0031]制作规格可以按照如下方式，每个检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒包括:
1、试剂I一瓶30ml (即试剂一)
2、试剂2—瓶IOml (即试剂二)
3、无乳链球菌标准品五瓶0.5ml/瓶
4、无乳链球菌质控一瓶0.2ml (对照用无乳链球菌异常血清)
5、一份使用说明书。
[0032]综上所述，本发明的试剂盒以及检测方法建立在抗原抗体结合的基础上，通过无乳链球菌单克隆抗体与乳胶偶联，并调整试剂一与试剂二的反应体系比例，实现无乳链球菌快速、高灵敏度的检测，本发明操作简便、快速，结果易于判断，无人为误差因素的影响。
[0033]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括: 试剂一，按质量体积比，其为包含1.5%~2%聚乙二醇的磷酸盐缓冲液，试剂一的pH值为7.38^7.42 ； 试剂二，按质量体积比，其为浓度为0.02%~0.04%的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒； 无乳链球菌标准品； 按体积比，试剂一与试剂二在反应体系中加入比例为2.5:1~3:1。
2.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其特征在于，按质量体积比，所述的磷酸盐缓冲液含2%聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述的试剂一，其PH值为7.42。
4.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其特征在于，还包括一对照用无乳链球菌异常血清。
5.根据权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒，其特征在于，试剂一与试剂二在反应体系中加入比率为3:1。
6.一种应用如权利要求1所述的检测无乳链球菌的免疫比浊法试剂盒的检测方法，其特征在于，包括步骤: A、在试剂一中加入无乳链球菌试验品，置于36.5 V~37.5°C孵育3~5min,然后加入试剂二，置于36.5°C ^37.5°C孵育，使无乳链球菌试验品中的无乳链球菌抗原与试剂二中的鼠抗人无乳链球菌单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，加入试剂二 5~15秒后，通过分光光度计在570nm处读取吸光度AO，3飞分钟后，再次通过分光光度计在570nm处读取吸光度Al,得出Δ A试验品=Al-AO ； B、通过已知的无乳链球菌标准品吸光度和无乳链球菌标准品浓度Sia计算无乳链球囷试验品浓度S验；计算公式为:Stl^= S标准X ΔΑ试验品/ Δ A标准。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的无乳链球菌试验品浓度在10ng/ml 至 300ng/ml。
【文档编号】G01N33/577GK103901204SQ201410145157
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】马东礼, 张会生 申请人:深圳市儿童医院