检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。方法步骤为：1）猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和96孔聚苯乙烯反应板包被；2）利用悬挂棉绳法，采集唾液，处理后获得唾液一抗；3）将唾液一抗，按编号加入抗原包被的反应板上，22-28℃饱和湿度反应1小时，洗涤；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，按顺序加入到反应板上，22-28℃饱和湿度避光反应30分钟，洗涤；5）将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到反应板上，避光反应15分钟，加入终止液；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本发明避免了单个动物采血的问题，适用于猪群大面积的猪瘟抗体调查。
【专利说明】检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。
【背景技术】
[0002]猪瘟(Classical swine fever, CSF)是目前危害我国养猪业最重要的疾病，其病理特征表现为小血管壁的变性，致使内脏器官多发性出血、梗塞和坏死，以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，对养猪业危害极大。
[0003]猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是引起猪痕的病原,该病具有高度接触性和致死性、传播速度快、流行广泛、发病率和死亡率高等特点。临床上，该病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发，一般导致高发病率和死亡率，而弱毒病毒感染则表现不明显。
[0004]猪瘟的发现已有180多年历史，世界各国均对该病的防控做出了巨大的努力，目前北美、澳洲和北欧的一些地区已成功地消灭了猪瘟，但猪瘟在其他许多地区仍广泛流行。墨西哥、巴西、南美的大部分地区猪瘟仍呈地方性流行，在加勒比地区古巴、海地和多米尼加都存在猪瘟，在东南亚地区的大多数国家仍存在猪瘟的间歇发生。
[0005]自从1969年在我国使用兔化弱毒疫苗后，猪瘟的暴发明显减少。目前在我国大陆和台湾地区仍有有猪瘟流行，其中大陆多以散发和慢性病例为主，但从20世纪80年代以后，临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟(或慢性猪瘟)成为该病的主要发生形式，持续感染普遍存在，疫苗的预防效果明显下降，使猪瘟防制遇到了新的困难。据估计，临床健康的猪群中，大约20%-30%的动物持续带毒；我国每年由猪瘟致死的猪占总死亡数的1/3，经济损失在20亿元左右。
[0006]目前，疫苗免疫依然是我国猪瘟防控的最主要手段。采集免疫后猪只血液样本，分离血清，并检测特异性的血清抗体，是目前监控猪瘟主要的手段，对猪瘟疫苗免疫效果评价、免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制，一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力，采集的样本数量不大，占猪群的比例不高,且对动物的应激非常大。固定一头体重在50公斤左右的生长猪，并从前腔静脉采集血液，通常需要2-3个人，平均花费10分钟左右。而本专利设计的唾液样本采集方法，则以同一栏的猪为单位采集(15-20头)，只需一个人，平均花费5分钟，悬挂和收集唾液采集绳，即可。相对而言，唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物，数据基本可代表整群动物的平均免疫情况，更能反映猪群抗体的总体水平。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。
[0008]检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法包括如下步骤:1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用；
3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用；
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0009]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以5%脱脂奶粉封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0010]所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
[0011]所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且已知阳性样品的OD值≥0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且待检唾液样品的OD值≥0.35，则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率> 80% ;否则判为阴性，即对应群体猪瘟抗体的阳性率< 80%。
[0012]本发明提供的猪瘟病毒唾液抗体采集和检测方法，避免了对单个动物采血的问题，相对于传统的血清抗体采集和检测方法，具有以下优点:1)唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激，2)节省采样时间达80%以上，3)节省2/3的采样人员，4)唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便，4)可以对整个猪群实行大面积采样，所得结果更客观全面，5)猪瘟病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在94%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法的过程示意图；
图2是本发明的利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗的示意图。
【具体实施方式】
[0014]检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法包括如下步骤:
1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板；
2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用；
3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用；
4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用；
5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应；
6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
[0015]所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以5%脱脂奶粉封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。
[0016]所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
[0017]所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N ≥2.1，而且已知阳性样品的OD值≥0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且待检唾液样品的OD值≥0.35，则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率> 80% ;否则判为阴性，即对应群体猪瘟抗体的阳性率< 80%。
实施例
[0018]I)以商品化的猪瘟病毒疫苗C株，1000 TCID50/ml (半数细胞感染量/毫升)浓度，感染ST细胞，培养48小时后，收集病毒液，4000g离心10min，取上清；35000g离心lh，获得纯化病毒，并滴定TCID50。将病毒液置于65°C水浴中，灭活30min，获得猪瘟全病毒纯化灭活抗原。将灭活抗原以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，，饱和湿度下，22-28°C孵育lh，然后转到4°C孵育16h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3,0.05% tween-20)稀释的5%脱脂奶粉IOOul/孔，于22-28°C封闭2h。弃去封闭液，拍干ELISA板，每孔加入150 ul洗液(PBST)，洗涤5 minX3次，拍干ELISA板，置于4°C备用，见图1。
[0019]2)以定制全棉绳索(6股、直径3mm、长Im)悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外，用力拧绳索，挤出浸润在绳索上的唾液，并收集于无菌的50ml离心管中，用于初步保存和运输(常温下、6小时内，或4°C下、72小时内运至实验室)。将唾液以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，并与4°C (<7d)或_20°C (<60d)保存备用，见图2。
[0020]3)将处理备用的唾液一抗，以PBST (1:1)稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上，IOOul/孔，每个样品3个重复，同时设置PBST阴性和血清阳性抗体对照个3个孔。饱和湿度下，22-28°C孵育lh。随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)，洗涤5 minX3次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0021]4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST为稀释液，作1:2000倍稀释后，按IOOul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中，22-28°C /饱和湿度反应30分钟，随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液(PBST)，洗涤5minX3次，拍干ELISA板，备用，见图1。
[0022]5) TMB显色剂由A液(TMB原粉以乙醇溶解配成4.0mg/ml，用时以超纯水稀释20倍)和B液(尿素过氧化氢以pH5.2磷酸盐缓冲液配制成0.15mg/ml终浓度)两种储存溶液组成，现用现配，配制比例为1:1。将配制好的TMB显色液按50ul/孔加入到上述反应孔中，室温避光反应15min，随后加入50ul/孔终止液(2M浓硫酸)，终止反应，见图1。
[0023]6)将终止后的反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值(P/N)≥2.1，而且已知阳性样品的OD值≥ 0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检口水样品与已知阴性样品的比值(P/N)≥2.1，而且待检唾液样品的OD值≥0.35，则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率≥80% ;否则判为阴性，即对应群体猪瘟抗体的阳性率< 80%。
[0024]本发明以相同的抗原包被板和分别优化的反应程序，对浙江省某4000头基础母猪的地规模化猪场，进行了唾液抗和血清抗体的检测对照实验。实际采样覆盖动物180头，采集唾液样本17个,采集血清样本180份。。如表1所示，相对血清抗体的采集(前腔静脉采血)，唾液抗体样本的采集在时间和人力需求上，具有明显优势。如表2所示，唾液抗体和血清抗体在最终结果的判断上，符合率在94%以上，完全可以满足临床大样本的抗体调查需要。
[0025]表1两种抗体田间采样所需人员和时间的对比
【权利要求】
1.一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用； 3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤I)为:以PH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以5%脱脂奶粉封闭，获得ELISA反应的抗原基质,置于4°C备用。
3.根据权利要求1所 述的一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N ^ 2.1，而且已知阳性样品的OD值> 0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≤2.1，而且待检唾液样品的OD值≤0.35，则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率> 80% ;否则判为阴性，即对应群体猪瘟抗体的阳性率< 80%。
【文档编号】G01N33/569GK103995119SQ201410147371
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】李龙, 章叶恩, 曹洋洋 申请人:杭州贝尔塔生物技术有限公司