一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法

文档序号:6224033阅读:1244来源:国知局
一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法,属于电化学传感【技术领域】。通过金-巯键作用将DNA-多肽复合物固定到金电极表面,再利用DNA杂交反应捕获DNA-金纳米粒子-电子介体纳米信号探针。当靶标蛋白酶存在时,胰蛋白酶剪切多肽上的精氨酸羧基位点,糜蛋白酶剪切另一条多肽上的酪氨酸羧基位点,使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面,导致相应电子介体的峰电流下降,据此,可实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的灵敏性和选择性同时检测。
【专利说明】—种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测中的应用,属于电化学传感【技术领域】。

【背景技术】
[0002]蛋白酶是生物体内的一类能够分解蛋白质的酶,蛋白酶功能紊乱将会导致包括癌症、病毒感染、神经退行性疾病等在内的疾病发生,使得蛋白酶成为临床研究热点。热量学、电化学方法、荧光、电感耦合等离子体-质谱、表面拉曼散射以及电泳等方法被广泛用于蛋白酶的生物实验。然而,这些方法大多用于单个蛋白酶的检测,难以对生物样品中多种蛋白酶进行同时测定。研究表明,蛋白酶很少单独发生作用,而是在一个称作“蛋白酶网络”的系统中发挥作用。因此,发展蛋白酶的快速和同时检测方法具有重要意义。
[0003]电化学生物传感由于灵敏度高、简单、快速、仪器小型化等特点,被广泛用于检测蛋白质、DNA和生物小分子等物质。为了提高检测灵敏度,纳米材料被引入生物传感器件的构建中,在众多的纳米材料中,金纳米粒子具有大比表面积、高表面能、良好的传导性和生物相容性,在生物传感器中作为生物分子和电子介体的载体以及电子传导体等得到了广泛应用。


【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供了一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测中的应用。
[0005]本发明是这样来实现的,先将DNAl-多肽I和DNA2-多肽2通过半胱氨酸的巯基以Au-S键方式固定到金电极表面,再将两种相应的纳米信号探针DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2/ -AuNPs-二茂铁通过DNA杂交反应组装到电极上。当胰蛋白酶和糜蛋白酶共存时,胰蛋白酶剪切多肽I的精氨酸羧基位点,糜蛋白酶剪切多肽2的酪氨酸羧基位点,使得部分DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2' -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针脱离电极表面,导致硫堇和二茂铁的峰电流下降。此外,由于两种蛋白酶对多肽剪切位点具有良好的特异性,而且电子介体硫堇和二茂铁的峰电位差异较大,因此,可成功用于胰蛋白酶和糜蛋白酶的高灵敏和选择性同时检测。
[0006]本发明采用以下技术方案:
(1)金纳米粒子的制备:50mL的0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾,然后加入I mL质量浓度为5%的柠檬酸三钠,继续搅拌并保持沸腾状态,直至溶液颜色由黄色变成深红色,继续保持沸腾10分钟,自然冷却至室温,将制备的金纳米粒子放在4° C冰箱中保存;
(2)DNA-多肽复合物的制备:将200 μ L 25 μ M多肽、200 μ L 5 μ M的DNA和lmg/mL链霉亲和素混合均匀,室温下反应3小时,未反应的DNA和多肽经6000转/分钟的转速超滤5分钟除去,得到DNA-多肽复合物,于4 ° C保存;
(3)电化学纳米信号探针的制备:将0.3 mL 25 μ M的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混合反应24小时,制备的DNA-AuNPs复合物用I M的NaCl稳定;将0.2 mL 0.1 mM的电子介体加入0.2 mL的DNA-AuNPs溶液中,在25 ° C持续搅拌反应24小时,加入I mL质量浓度1%的BSA,反应I小时。所得溶液在16000转/分钟下离心10分钟,去除上层清液,将产物重悬于浓度为10 mM、pH 7.7的磷酸盐缓冲溶液中,制成DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2' -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针。
[0007](4)基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学传感器构建:将金电极浸入DNAl-多肽I和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时,用I mM的巯基己醇封闭I小时,再浸入含有DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2' -AuNPs-二茂铁纳米信号探针的溶液中,通过DNA杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。
[0008]基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测应用:将制备的电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟,胰蛋白酶剪切多肽I上的精氨酸羧基位点,糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点,使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面,导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降。随着蛋白酶浓度的增大,硫堇和二茂铁的峰电流减小,峰电流减小的程度与胰蛋白酶和糜蛋白酶在
0.006-0.18 μ g/mL和0.0055-0.25 μ g/mL范围内呈良好的线性关系,检测限分别为2.5ng/mL和1.6 ng/mL,表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测。
[0009]本发明的技术效果是:本发明利用金-巯键作用将制备的DNA-多肽复合物固定于电极表面,进而通过DNA杂交反应将两种具有明显电位差异的纳米信号探针组装于电极上,在胰蛋白酶和糜蛋白酶对电极表面相对应多肽的选择性剪切作用下,纳米信号探针随之脱离电极表面,使得电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降,其下降程度与相对应的蛋白酶的浓度呈线性,可实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的高灵敏度和选择性同时识别检测,具有良好的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1是(A) DNA-多肽复合物和(B)纳米信号探针合成示意图,(C)传感器构建示意图。
[0011]图 2 是(a) Au NPs, (b)DNAl',(c) DNA2',(d) DNAl; -Au NPs, (e) DNA2' -AuNPs, (f) Thi, (g) DNAl' -Au NPs-Thi, (h) DNA2' -Au NPs-Fc 和(i) Fe 的紫外可见光谱图。
[0012]图3 是(a) Thi, (b)DNAl' -Au NPs-Thi, (c) Fe 和(d) DNA2' -Au NPs-Fc 的傅里叶变换红外光谱图。
[0013]图4是不同电极的交流阻抗谱图:(a)裸金电极,(b)两种多肽修饰电极,(c) MCH/多肽修饰电极,(d)纳米探针/多肽修饰电极,(e)胰蛋白酶和糜蛋白酶剪切后的电极。内插图为等效电路图;Rs,Zw, Ret和Cdl分别表示溶液的电阻,Warburg扩散电阻,电子转移阻抗和双层电容。
[0014]图5是不同电极的SEM图:(A)多肽修饰金片,(B)两种纳米探针/多肽修饰金片,(C)胰蛋白酶和糜蛋白酶剪切后的金片。
[0015]图6是(A)胰蛋白酶检测的脉冲伏安曲线,从a到j的胰蛋白酶浓度为:0,0.005,0.02, 0.06, 0.1,0.15, 1.5,4,6,7 μ g/mL ; (B)胰蛋白酶线性关系,(C)糜蛋白酶检测的脉冲伏安曲线,从a到j的糜蛋白酶浓度为:0,0.001, 0.005, 0.05, 0.1,0.2,I, 2,5,6 μ g/mL, (D)糜蛋白酶线性关系图。
[0016]图7是交叉反应实验:(A)两种酶都不存在,(B)只有0.1 μ g/mL胰蛋白酶存在,(C)只有0.1 μ g/mL糜蛋白酶存在,(D)0.1 μ g/mL胰蛋白酶和0.1 μ g/mL糜蛋白酶同时存在。
[0017]图8是(A)不同浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶同时存在时的脉冲伏安曲线;(B)胰蛋白酶的线性曲线;(C)糜蛋白酶的线性曲线。

【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述,本发明并不限于此。
[0019]实施例1
DNA-多肽复合物和电化学纳米信号探针的制备:
(1)DNA-多肽复合物的制备:将200μ L 25 μ M多肽、200 μ L 5 μ M的DNA和lmg/mL链霉亲和素混合均匀,室温下反应3小时,未反应的DNA和多肽经6000转/分钟的转速超滤5分钟除去,得到DNA-多肽复合物,于4 ° C保存;
(2)电化学纳米信号探针的制备:50mL的0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾,然后加入I mL质量浓度为5%的柠檬酸三钠,继续搅拌并保持沸腾状态,直至溶液颜色由黄色变成深红色,继续保持沸腾10分钟,自然冷却至室温,制成金纳米粒子溶液。将0.3 mL 25 μ M的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混合反应24小时,制备的DNA-AuNPs复合物用I M的NaCl稳定;将0.2 mL 0.1 mM的电子介体加入0.2 mL的DNA-AuNPs溶液中,在25° C持续搅拌反应24小时,加入I mL质量浓度1%的BSA,反应I小时。所得溶液在16000转/分钟的转速下离心10分钟,去除上层清液,将产物重悬于浓度为10 mM、pH 7.7的磷酸盐缓冲溶液中,制成DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2' -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针。
[0020]采用紫外-可见分光光谱对纳米信号探针进行表征,结果如图2所示。520 nm处的吸收峰表明Au NPs的粒径约14 nm左右(曲线a)。当通过Au-S键将DNAl ’ (曲线b)和DNA2'(曲线 c)组装到 Au NPs 表面后,DNAl' -Au NPs (曲线 d)和 DNA2' -Au NPs (曲线e)在约253 nm处都出现了 DNA的紫外吸收峰。硫堇(曲线f)在600 nm和565 nm处有两个特征吸收峰。当将硫堇吸附在DNAl' -Au NPs上时(曲线g),这两个硫堇的特征峰仍然存在,但是565 nm处的吸收峰增大并稍微蓝移,这是由于硫堇分子和Au NPs之间发生反应导致,同时,在255 nm处出现了 DNAl'的特征吸收峰。DNA2' -Au NPs-Fc复合物(曲线h)在527 nm和257 nm附近出现两个吸收峰,分别对应于Au NPs的紫外吸收和DNA2, (260 nm)与二茂铁(253 nm,曲线i)的重叠峰。以上结果表明,采用本发明的方法合成了 DNAP -AuNPs-Thi 和 DNA2' -AuNPs-Fc 纳米信号探针。
[0021 ]图 3 是 Th1、DNAl' -Au NPs-Th1、Fe 和 DNA2' -Au NPs-Fc 的红外光谱图。曲线a是硫堇的红外谱图,在3310 CnT1和3150 cnT1处的吸收峰对应于氨基N-H的伸缩振动,850CnT1处的吸收峰对应于氨基N-H的弯曲振动;在DNAl丨-Au NPs-Thi红外光谱中(曲线b),以上三个特征峰都没有出现,表明硫堇的氨基的两个氮原子通过Au-NH2键作用将硫堇组装到了 Au NPs表面,而在1600 CnT1和1495 cnT1处出现的两个吸收峰对应于硫堇的苯环骨架振动,而且,在1226 cnT1和1660 cnT1附近出现了 DNA磷酸根的反对称伸缩振动和碱基上C=O伸缩振动,以上结果进一步表明,成功合成了 DNAl' -Au NPs-Thi纳米信号探针。与二茂铁(曲线 c)的红外光谱相比,FC-DNA2' -Au NPs (曲线 d)在 2930 cnT1、1410 cnT1、1105 cnT1 和816 cnT1附近出现了二茂铁的特征吸收峰以及在1657 cnT1和1230 cnT1附近出现了 DNA的特征吸收峰,表明二茂铁成功修饰到了 Au NPs表面。由二茂铁和Fc-DNA2' -Au NPs的红外光谱图可见,二茂铁在2556 cnT1处有特征吸收峰,而在FC-DNA2, -Au NPs中该吸收峰消失,这是因为2556 cm—1对应于二茂铁的S-H键吸收,当形成DNA2, -Au NPs-Fc后,S-H键断裂形成新的S-Au键。综上所述,采用本发明方法成功合成了两种纳米信号探针。
[0022]实施例2
基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学传感器构建:
将处理好的金电极浸入DNAl-多肽I和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时,用ImM的巯基己醇封闭I小时,再浸入含有DNAl' -Au NPs-Thi和DNA2' -Au NPs-Fc纳米信号探针的溶液中,通过DNA杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。
[0023]采用电化学交流阻抗法对传感器的制备过程进行表征,结果如图4所示。裸金电极(曲线a)有一个很小的半圆区域,表明金电极表面电子传递速度快。当裸金电极浸入含有两种多肽的溶液中时(曲线b),阻抗迅速增加到1358 Ω。将电极用MCH封闭后(曲线C),阻抗进一步增大。当纳米探针DNAl' -Au NPs-Thi和DNA2' -Au NPs-Fc组装到电极表面时(曲线d),阻抗增大到3285 Ω,表明纳米信号探针通过DNA杂交修饰到了电极上。将纳米信号探针修饰电极浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合溶液中反应25分钟后(曲线e),阻抗减小为2389 Ω,表明在胰蛋白酶和糜蛋白酶对相应多肽的剪切作用下,部分多肽连接的纳米信号探针脱离电极表面,导致阻抗下降。
[0024]为了进一步验证电极的组装过程,我们使用SEM来表征剪切过程。如图5所示,多肽修饰金片(A)光滑并且均匀;当组装了 DNAl' -Au NPs-Thi和DNA2' -Au NPs-Fc后,SEM图(B)中出现了很多大小均一的纳米粒子,表明纳米探针成功组装到了金片表面;进一步将纳米探针修饰金片浸入一定浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶溶液中,剪切25分钟后,金片表面纳米颗粒数目明显减少,表明蛋白酶成功将多肽剪切使得纳米信号探针脱离电极表面。该现象与EIS所得结果相一致,表明采用本发明建立的方法可成功制备用于蛋白酶活性检测的传感器。
[0025]实施例3
(2)传感器对单个蛋白酶的检测
先以胰蛋白酶为例,验证本发明方法对蛋白酶的识别检测应用。将DNAl-多肽I通过Au-S键固定在金电极表面,再通过DNA杂交反应将纳米信号探针Th1-DNAl' -AuNPs固定到电极上。由图6A可见,当胰蛋白酶存在时,硫堇的峰电流降低,表明胰蛋白酶剪切了多肽I上特定精氨酸的羧基位点,部分多肽I连接的纳米信号探针脱离电极表面导致电信号下降。随着胰蛋白酶浓度的增加,硫堇的峰电流逐渐减小。图6B是硫堇的峰电流和胰蛋白酶的浓度关系曲线图,在信噪比为3时,胰蛋白酶的线性范围为0.005-0.15 yg/mL,检测限为
1.8 ng/mL。同样,将DNA2-多肽2以及纳米信号探针Fc_DNA2 ' -AuNPs固定到金电极表面,可构建用于检测糜蛋白酶的传感器。由图6C可见,糜蛋白酶剪切多肽2上特定酪氨酸的羧基位点,使得部分多肽2连接的纳米信号探针二茂铁从电极上脱离导致信号下降。图6D是二茂铁的峰电流和糜蛋白酶浓度的关系曲线,糜蛋白酶的线性范围是0.005-0.2 yg/mL,检测限是1.2 ng/mL。以上结果表明,本方法可用于对胰蛋白酶和糜蛋白酶的单独灵敏性检测。
[0026](3)传感器对两种蛋白酶的同时检测
为了验证本发明建立方法对胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测的可行性,设计了分析物之间的交叉干扰实验,结果如图7所示。当两种蛋白酶都不存在时,构建的传感器在-0.24 V和+0.38 V分别出现了硫堇和二茂铁的伏安峰(图7A),表明通过DNA杂交可实现纳米信号探针在电极表面的固定。当0.1 μ g/mL胰蛋白酶存在时,硫堇的峰电流明显下降,而二茂铁的峰电流几乎保持不变(图7B)。当0.1 μ g/mL糜蛋白酶存在时,硫堇的峰电流几乎保持不变,而二茂铁的峰电流明显降低(图7C)。以上结果表明,检测胰蛋白酶和糜蛋白酶时不会产生交叉干扰。此外,当同时存在0.1 μ g/mL胰蛋白酶和0.1 μ g/mL糜蛋白酶时,硫堇和二茂铁的峰电流都明显降低(图7D),表明本方法能在同一电极表面实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的同时检测,彼此之间没有交叉干扰,具有很好的选择性。
[0027]将制备的电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟,胰蛋白酶剪切多肽I上的精氨酸羧基位点,糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点,使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面,导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降。随着蛋白酶浓度的增大,硫堇和二茂铁的峰电流减小,峰电流减小的程度与胰蛋白酶和糜蛋白酶在0.006-0.18 μ g/mL和0.0055-0.25 μ g/mL范围内呈良好的线性关系,检测限分别为2.5 ng/mL和1.6 ng/mL,结果如图8所示。以上研究结果表明,本发明建立的传感方法可用于多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测,在诊断医学上有很好的应用前旦
-5^ O
【权利要求】
1.一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法,其特征在于:将电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟,胰蛋白酶剪切多肽I上的精氨酸羧基位点,糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点,使得连接于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面,导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降,随着胰蛋白酶和糜蛋白酶浓度的增大,硫堇和二茂铁的峰电流逐渐减小,峰电流减小的程度分别与胰蛋白酶和糜蛋白酶在0.006-0.18 yg/mL和0.0055-0.25 μ g/mL范围内呈良好的线性关系,检测限分别为2.5 ng/mL和1.6 ng/mL,表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法,其特征在于:所述的电化学传感器,构建方法为:将金电极浸入DNAl-多肽I和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时,用I mM的巯基己醇封闭I小时,再浸入含有DNAl丨-AuNPs-硫堇和DNA2丨-AuNPs- 二茂铁纳米信号探针的溶液中,通过DNA杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。
3.根据权利要求2所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法,其特征在于:DNA-AuNPs-电子介体纳米信号探针的制备方法包括以下步骤: (1)金纳米粒子的制备:50mL的0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾,然后加入I mL质量浓度为5%的柠檬酸三钠,继续搅拌并保持沸腾状态,直至溶液颜色由黄色变成深红色,继续保持沸腾10分钟,自然冷却至室温,将制备的金纳米粒子放在4° C冰箱中保存; (2)DNA-多肽复合物的制备:将200 μ L 25 μ M多肽、200 μ L 5 μ M的DNA和lmg/mL链霉亲和素混合均匀,室温下反应3小时,未反应的DNA和多肽经6000转/分钟的转速超滤5分钟除去,得到DNA- 多肽复合物,于4 ° C保存; (3)电化学纳米信号探针的制备:将0.3 mL 25 μ M的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混合反应24小时,制备的DNA-AuNPs复合物用I M的NaCl稳定;将0.2 mL 0.1 mM的电子介体加入0.2 mL的DNA-AuNPs溶液中,在25 ° C持续搅拌反应24小时,加入I mL质量浓度1%的BSA,反应I小时,所得溶液在16000转/分钟的转速下离心10分钟,去除上层清液,将产物重悬于浓度为10 mM、pH为7.7的磷酸盐缓冲溶液中,制成DNAl' -AuNPs-硫堇和DNA2! -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针。
【文档编号】G01N27/26GK104049007SQ201410148663
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】邱建丁, 田小翠, 梁汝萍 申请人:南昌大学
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