A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡及其制备方法，旨在提供一种检测方法简便，灵敏度高且检测结果可靠的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡；该检测试剂卡，包括带盒盖的盒体(6)，盒体(6)内设有检测试纸，所述的检测试纸包括底板(1)，底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)、包被膜(4)和吸水垫(5)，所述的包被膜(4)上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列；属于荧光免疫检测领域。
【专利说明】A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种检测试剂卡，具体的说是，一种测定咽部拭子中A族链球菌的检测试剂卡，本发明还公开了该检测试剂卡的制备方法，属于荧光免疫检测领域。
【背景技术】
[0002]小儿上呼吸道感染的常见病原体之一，在呼吸道感染患儿中A族链球菌阳性率约为23.2%。如不及时接受抗感染治疗，包括急性咽炎、脓胞病、中毒性休克综合征、侵袭性筋膜炎、猩红热、肺炎、丹毒和A族链球菌感染后引起的变态反应性疾病，如急性风湿热、风湿性心脏病、急性肾小球肾炎。目前普遍的A族链球菌鉴定方法主要有临床经验甄别、细菌培养法。
[0003]根据临床经验诊断A族链球菌的准确率偏低，据资料统计，即使经验丰富的医生诊断的准确率也只有45% -75%。细菌培养法是A族链球菌诊断的“金标准”，该方法是将采取的咽拭子接种于血琼脂平板上孵育24?48h，10% CO2或厌氧条件下可增加A族链球菌的分离率，最终采取血清学方法鉴别A族链球菌与其他β溶血性链球菌，特别是C族和G族，但是需要的时间较长。
【发明内容】
[0004]针对上述不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、诊断迅速、检检测结果可靠的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供的前一技术方案如下:该A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，包括带盒盖的盒体,盒体内设有检测试纸,所述的检测试纸包括底板，底板上依次衔接有样品垫、抗A族链球菌抗体量子点标记垫、包被膜和吸水垫，所述的包被膜上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列。
[0006]上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的盒体的盒盖上设有加样孔和结果观察窗口。
[0007]上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的包被膜两端分别与吸水垫和抗A族链球菌抗体量子点标记垫相互交叠连接,在抗A族链球菌抗体量子点标记垫上压贴有样品垫。
[0008]进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的样品垫为玻璃纤维样品垫。
[0009]进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，所述的包被膜为硝酸纤维素膜。
[0010]进一步的,上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡,所述的抗A族链球菌抗体量子点标记垫为含量子点标记抗体的聚酯纤维素膜。
[0011]本发明的后一技术方案是提供该检测卡的制备方法，该方法依次包括下述步骤:在底板上依次衔接有样品垫、抗A族链球菌抗体量子点标记垫、包被膜和吸水垫:
[0012]其中:
[0013]I)样品垫的制备方法是:
[0014]将样品垫用样品垫缓冲液浸泡20~30分钟，干燥；
[0015]2)抗A族链球菌抗体量子点标记垫的制备方法是:
[0016]①用量子点缓冲液将水溶性羧基量子点QD525稀释至I μ M ;
[0017]②取ImLlyM的量子点，加入30 μ L的1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应I~2小时，用30kDa的超滤管超滤，除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸，吸取超滤管内剩余液体，加入IOmM的硼酸缓冲液恢复为体积至ImL ；
[0018]③将抗A族链球菌抗体加入IOOkDa的超滤管中，用硼酸缓冲液调整抗体含量为4mg/mL,按200 μ g/lmL的量，将步骤B)中的抗体加入到步骤A)中的量子点溶液中，室温反应I~2小时；
[0019]④按10 μ L/lmL的量，向步骤C)中加入甘氨酸，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30~60min ；
[0020]⑤将步骤D)偶联抗 体的量子点溶液加入到的超滤管中，加入Tris-HCl溶液置换量子点缓冲液，重复3~5次，吸取超滤管内剩余液体，加入Tris-HCl至终体积为100 μ L，离心分离，取上清，并加入抗体保存液；
[0021]⑥将上述所得的溶液用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为I~5μ L/cm，干燥；
[0022]3)包被膜的制备方法是:
[0023]①将羊抗兔抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释0.5~2mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液；
[0024]②将抗A族链球菌抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至0.8~1.5mg/mL,加入3 %的甲醇，即为检测区工作液；
[0025]③将步骤①、步骤②)所得的溶液，用喷金划膜仪以0.8-1.2 μ L/cm包被到硝酸纤维膜上，检测区与质控区间距为0.4-0.7cm，位于硝酸纤维素膜中间位置，将硝酸纤维膜放入37°C烘箱中，干燥即可。
[0026]进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，步骤①所述的量子点缓冲液为PH8.4的硼酸盐缓冲液。
[0027]进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，所述的样品垫缓冲液为含0.5~5wt% BSA、0.5~5wt %聚乙烯吡咯烷酮、0.5~5wt%聚乙二醇、
0.1~5?七％吐温-20、I~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液。
[0028]进一步的，上述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，所述的抗体保存液为含lwt% BSA,20wt%鹿糖，10wt%海藻糖，0.1wt %吐温-20,0.lwt%聚乙烯批咯烷酮的0.05M Tris-HCl缓冲液。
[0029]与现有技术相比，本发明所提供的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡具有如下优点:
[0030]本发明提供的技术方案，利用两种抗体的特异结合反应，形成特异的“三明治”结构，即“抗体-抗原-抗体”免疫复合物，结合免疫层析技术，应用荧光免疫层析法检测A族链球菌抗原，并与荧光试剂卡读卡仪相配合，大幅度提高A族链球菌的检出率。
[0031]本方法操作简单，诊断迅速，特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门的操作人员，只需简单的仪器设备，即可得出结果。这样有利于医护人员抓住最佳治疗时间，避免抗生素的滥用，同时降低A族链球菌变态反应发生的几率。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是本发明提供的检测试剂卡结构示意图；
[0033]图2是本发明提供的检测试剂卡的盒盖俯视图；
[0034]图3是本发明提供的检测试纸结构示意图；
[0035]图4是本发明提供的检测试纸俯视图；
[0036]图5是本发明提供的检测卡判定结果为阴性时示意图；
[0037]图6是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图。
[0038]其中:底板1，样品垫2，抗A族链球菌抗体量子点标记垫3，包被膜4，吸水垫5，A族链球菌抗体检测区T线，羊抗兔多克隆抗体质控区C线，盒体6，盒盖61，加样孔71，结果观察窗口 72。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
[0040]实施例1
[0041]本发明提供的一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，参阅图1至图4，所述的检测试剂卡包括带盒盖61的盒体6，为了方便加样和观察检测结果，所述的盒盖61上设有加样孔71和结果观察窗口 72。
[0042]盒体6内设有检测试纸，所述的检测试纸包括底板1，所述的底板I为PVC板，在底板I上依次衔接有样品垫2、抗A族链球菌抗体量子点标记垫3、包被膜4和吸水垫5，在包被膜4上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列。为了达到快速、准确的检测结果，所述的样品垫2优选玻璃纤维样品垫；所述的包被膜4优选硝酸纤维素膜；所述的抗A族链球菌抗体量子点标记垫3为聚酯纤维素膜。
[0043]更具体的说，所述的包被膜4压贴在底板I中间部位，包被膜4的两端分别与吸水垫5和抗A族链球菌抗体量子点标记垫3相互交叠连接,在抗A族链球菌抗体量子点标记垫3上压贴有样品垫2。
[0044]样品垫2压在抗A族链球菌抗体量子点标记垫3的1/3?1/4左右,抗A族链球菌抗体量子点标记垫3压在包被膜的1_处，A族链球菌抗体检测区T线距离包被膜4左端IOmm,羊抗兔多克隆抗体质控区C线距离包被膜4右端10mm, C、T线间距4?7mm(优选5mm),吸水垫压在包被膜I?2.5mm(优选2mm)处。
[0045]本发明还提供的该A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法:
[0046]I)样品垫的制备方法是:[0047]将样品垫用含0.5~5wt%BSA、0.5~5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5~5wt%聚乙二醇、0.1~5￥七％吐温-20、1~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液(0.01M磷酸氢二钠:0.01M磷酸二氢钠=81:19 (V:V)) (pH7.4)浸泡完全后，37°C烘干或在相对湿度≤35%的环境下干燥。
[0048]样品垫缓冲液优选为0.01M磷酸盐缓冲液中溶解0.5wt% BSA、0.5被％聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt%聚乙二醇、0.25wt%吐温-20和Iwt %曲拉通-100。
[0049]2)抗A族链球菌抗体量子点标记垫的制备方法是:
[0050]①用IOmM pH8.4的硼酸缓冲液(2.5mM硼砂:10mM硼酸=4.5:5.5 (V: V))，将水溶性羧基量子点8 μ M的QD525稀释至I μ Μ。
[0051]②取ImLlyM的量子点，加入30 μ L10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应I~2小时。用30kDa的超滤管超滤，除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸，吸取超滤管内剩余液体，加入IOmM的硼酸缓冲液恢复为体积至ImL。
[0052]③将抗A族链球菌抗体加入IOOkDa的超滤管中，用IOmM硼酸缓冲液调整抗体含量为 4mg/mL。
[0053]③按200 μ g/lmL的量，将步骤②制备的抗体加入到步骤①量子点溶液中，室温反应I~2小时。
[0054]④按10 μ L/lmL的量，向步骤③中加入10mg/mL的甘氨酸，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30~60min。
[0055]⑤将偶联抗体的量子点溶液加入到30kDa的超滤管中，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl溶液置换溶液缓冲体系，重复3~5次，恢复终体积为100 μ L。
[0056]⑥将步骤⑤中的溶在液4°C 1800g离心，取上清液。
[0057]⑦在步骤⑥所得的上清液中加入100 μ L抗体保存液，所述的体保存液为含Iwt %BSA, 20wt %鹿糖，IOwt %海藻糖，0.1wt %吐温-20和0.1wt %聚乙烯批咯烧酮的0.05MTris-HCl缓冲液。
[0058]⑧将上述所得的溶液用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为I~5 μ L/cm(优选2 μ L/cm)，放入37°C烘箱，干燥2~5小时。
[0059]3)包被膜的制备方法是:
[0060]①将羊抗兔抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至lmg/mL，加入3%的甲醇，即为质控
区工作液。
[0061]②将抗A族链球菌抗体2用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1.2mg/mL,加入3%的甲醇，即为检测区工作液。
[0062]③将①、②所得的溶液，用喷金划膜仪以I μ L/cm包被到硝酸纤维膜上。检测区与质控区间距为0.4~0.7cm (优选0.5cm)，位于硝酸纤维素膜中间位置。
[0063]④将步骤③硝酸纤维膜放入37°C烘箱中，干燥过夜。
[0064]4)组装:
[0065]①硝酸纤维素膜的粘贴:轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上。
[0066] ②吸水垫的粘贴:将PVC板平铺于工作台面上，轻轻揭开PVC板上吸收垫粘贴处的保护膜，将吸收垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸收垫覆盖在NC膜上Imm处。
[0067]③抗A族链球菌抗体量子点标记垫的粘贴:将量子点标记垫裁为5mmX 300mm。轻轻揭开NC膜上缘量子点标记垫粘贴处的保护膜，将胶体金量子点标记垫粘附于其上，方法同吸收垫。抗A族链球菌抗体量子点标记垫3覆盖在NC膜上1_处。
[0068]④样品垫的粘贴:将干燥后的样品垫裁为18mmX 300mm后，轻轻揭开薄板最上端的保护膜，将样品垫粘附于抗A族链球菌抗体量子点标记垫3上部，方法同吸收垫。样品垫覆盖在抗A族链球菌抗体量子点标记垫上2_处。
[0069]⑤抗A族链球菌抗体量子点标记垫的加固:将衔接胶带裁为12mmX300mm,粘贴到样品垫处，顶端距试纸条样品垫端15mm。
[0070]⑥切条与装卡:将粘贴好的PVC板切成3.0mm(2.5?4.5mm)宽的试纸条。将每一试纸条装入塑料卡内，将每一试剂卡置于铝膜袋中，并加入Ig干燥剂I包，热合封口。
[0071]该A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的具体使用方法:
[0072]取样后，在抽提管中加入裂解液A(1M亚硝酸钠)和裂解液B(2M乙酸)各3?4滴，放入棉拭子后挤压几次，静置3?5min。
[0073]检测时，参阅图5和图6，将样本裂解液滴入本检测试剂的加样孔中3?4滴，由于毛细管作用检测样品将沿着检测试纸向吸水垫端移动，样品中的A族链球菌经过裂解液裂解后，可与抗A族链球菌多克隆抗体荧光标记探针发生特异结合，然后继续移动与包被在硝酸纤维素膜上的抗体结合，从而被抗A族链球菌的多克隆抗体识别，即发生双抗体夹心的特异结合，用手持式紫外线灯照射观察窗口，在检测区出现量子点荧光条带，从而通过检测样本中的A族链球菌进行呼吸道感染病源的鉴定。检测过程中，当上行液面即滞留于检测区的荧光探针将显示相应的荧光。即设定A族链球菌界限值为103CFU/mL，当质控区和检测区都有荧光出现时，说明样品中A族链球菌的含量超过103CFU/mL，为阳性；当只有质控区有荧光而检测区无荧光出现时，说明样品中不含A族链球菌或者含量低于103CFU/mL，为阴性。
[0074]当移动至羊抗兔多克隆抗体质控区时，无论样品中A族链球菌有无，荧光探针都会与硝酸纤维素膜上包被的羊抗兔IgG结合滞留，使质控区显示荧光。因此质控区无荧光产生则代表操作有误或检测结果无效，需重复试验。
[0075]为了更好的说明本发明的有益效果，下面给出采用本发明提供的检测试剂卡与传统的细菌培养检测法，临床经验甄别发的结果对比实验。
[0076]检测例I
[0077]
【权利要求】
1.一种A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，包括带盒盖的盒体(6)，盒体(6)内设有检测试纸，所述的检测试纸包括底板(I)，其特征在于，底板(I)上依次衔接有样品垫(2)、抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)、包被膜(4)和吸水垫(5)，所述的包被膜(4)上设有一条A族链球菌抗体检测区T线和一条羊抗兔多克隆抗体质控区C线，两条线平行排列。
2.根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的盒体(6)的盒盖(61)上设有加样孔(71)和结果检测窗口(72)。
3.根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的包被膜(4)两端分别与吸水垫(5)和抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)相互交叠连接，在抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)上压贴有样品垫(2)。
4.根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的样品垫(2)为玻璃纤维样品垫。
5.根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的包被膜(4)为硝酸纤维素膜。
6.根据权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的抗A族链球菌抗体量子点标记垫为包被量子点标记A族链球菌抗体聚酯纤维素膜。
7.制备权利要求1所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡，其特征在于，依次包括下述步骤:在底板(I)上依次衔接有样品垫(2)、抗A族链球菌抗体量子点标记垫(3)、包被膜⑷和吸水垫(5): 其中: .1)样品垫的制备方法是: 将样品垫用样品垫缓冲液浸泡20~30分钟，干燥。 .2)抗A族链球菌抗体量子点标记垫的制备方法是: ①用量子点缓冲液将水溶性羧基量子点QD525稀释至Iμ M ; ②取ImLlyM的量子点，加入30μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应I~2小时，用30kDa的超滤管超滤，除去未反应的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸，吸取超滤管内剩余液体，加入IOmM的硼酸缓冲液恢复为体积至.1mL ； ③将抗A族链球菌抗体加入IOOkDa的超滤管中，用硼酸缓冲液调整抗体含量为4mg/mL，按200μ g/lmL的量，将步骤B)中的抗体加入到步骤A)中的量子点溶液中，室温反应.1~2小时； ④按10μL/lmL的量，向步骤C)中加入甘氨酸，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应.30 ~60min ； ⑤将步骤D)偶联抗体的量子点溶液加入到的超滤管中，加入Tris-HCl溶液置换量子点缓冲液，重复3~5次,吸取超滤管内剩余液体,加入Tris-HCl至终体积为100 μ L,离心分离，取上清，并加入抗体保存液； ⑥将上述所得的溶液用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为I~5μL/cm，干燥。 .3)包被膜的制备方法是: ①将羊抗兔抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释0.5~2mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液； ②将抗A族链球菌抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至0.8~1.5mg/mL,加入3%的甲醇，即为检测区工作液； ③将步骤①、步骤②所得的溶液，用喷金划膜仪以0.8-1.2 μ L/cm包被到硝酸纤维膜上，检测区与质控区间距为0.4-0.7cm，位于硝酸纤维素膜中间位置，将硝酸纤维膜放入.37°C烘箱中，干燥即可。
8.根据权利要求7所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于，步骤2)①中所述的量子点缓冲液为pH8.4的硼酸盐缓冲液。
9.根据权利要求7所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述的样品垫缓冲液为含0.5~5wt% BSA、0.5~5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5~.5wt%聚乙二醇、0.1~5wt%吐温-20、I~5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求7所述的A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述的抗体保存液 为含lwt% BSA,20wt%鹿糖，10wt%海藻糖,0.]^1:%吐温-20,.0.1wt %聚乙烯吡咯烷酮的0.05M Tris-HCl缓冲液。
【文档编号】G01N33/533GK103926403SQ201410178876
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】汤永平, 张晓丽, 潘秀华 申请人:广州市微米生物科技有限公司