Psa2蛋白在作为缺氧预适应生物标记物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了PSA2蛋白在作为缺氧预适应生物标记物中的应用。本发明提供了鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品，包含用于检测PSA2蛋白的物质；还包含记载有如下内容的载体：若所述待测动物或细胞中PSA2蛋白的含量高于对照动物或细胞中PSA2蛋白的含量，则所述待测动物或细胞处于缺氧预适应状态或候选处于缺氧预适应状态；反之，则所述待测动物或细胞不处于缺氧预适应状态后候选不处于缺氧预适应状态；所述对照动物或细胞为：与所述待测动物或细胞分类命名相同，且未经缺氧处理的正常的动物或细胞。实验证明，缺氧预适应后，PSA2蛋白在脑组织中含量明显增加；本发明对缺氧相关疾病做出早期诊断和干预治疗有很大帮助。
【专利说明】PSA2蛋白在作为缺氧预适应生物标记物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及PSA2蛋白在作为缺氧预适应生物标记物中的应用，特别涉及检测PSA2蛋白含量的仪器或/和物质在制备鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用。
【背景技术】
[0002]缺氧，是指因为组织的氧气供应不足或者用氧障碍，从而导致组织器官的代谢、功能甚至形态结构发生异常变化的病理生理过程。缺氧虽然不能作为单独的疾病存在，但却是临床各种疾病中十分常见的一类病理过程，严重时甚至会导致器官的损伤或者功能的障碍。针对这一广泛存在的病理过程，寻找提升机体抗缺氧能力的药物和措施一直是研究的热点。经过实验研究发现，动物或细胞经过非致死量的缺氧刺激后，可以对随后出现的更严重的缺氧产生耐受性，从而减轻缺氧对动物或者细胞的损伤，即会产生缺氧预适应(Hypoxic Preconditioning, HPC)的保护作用。HPC的机制可能与抗缺氧活性物质的产生或者内源性保护通路的激活等因素有关，但目前机制仍然未被阐明。蛋白质作为生物体内具体功能的执行者是生命的物质基础，在机体受到缺氧刺激之后，会引起体内蛋白质表达与含量的动态改变。因此，通过对比经过缺氧预适应刺激后动物的重要组织器官与未经过缺氧刺激的动物蛋白质的系统动态研究，有助于从蛋白质层次上揭示缺氧预适应的发生过程，可能为我们找到相关抗缺氧蛋白质，对于预防缺氧损伤有着重要的意义。生物标志物，一般指可以提供客观测定和评价的一个普通生理或病理指标，通过对它的测定便可以判断机体当前所处的生物学过程中的进程。特异性的生物标志物对于疾病的鉴定、早起诊断、预防、治疗以及愈后判定都有着积极的帮助租用，因此，寻找和发现有价值的生物标志物对于临床研究有着重要意义。鉴于缺氧损伤存在的广泛性与损伤结果的严重性，针对缺氧预适应相关蛋白生物标志物的研究便有着深远的意义。从蛋白质的层次上寻找缺氧预适应相关蛋白生物标志物，从而为后期研发抗缺氧药物提供可能的思路与靶点。
[0003]蛋白质组学，是指一种基因、细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是一种在整体、大规模水平上研究蛋白质的特征，包括表达水平，翻译后的修饰等等，从而获得在机体受到外源性刺激前后，蛋白质整体水平上的变化情况。目前，蛋白质组学中最常用且较为先进的方法为双向突光差异凝胶电泳(Two dimensional difference in gelelectrophoresis, 2D-DIGE)。它是在传统的双向电泳的基础上发展起来的新型蛋白质组学定量分离计数。DIGE实验使用三种荧光染料(Cy2Cy3和Cy5)标记蛋白质，并且在同一张凝胶上对标记好的三组蛋白质混合物进行电泳分离，是一种多通道的蛋白分离技术，消除了因为凝胶差异而造成的误差。于此同时，用Cy2标记所有蛋白质的混合物作为内参，在凝胶扫描后，使用专门的软件将蛋白质的变化与内标含量进行比对分析，采用特殊的算法，给出准确可靠的定量信息，提高了实验的重复性和准确性，减少了假阳性结果。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品。
[0005]本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品，包含用于检测PSA2蛋白的物质。
[0006]在本发明中，所述缺氧预适应是指动物或细胞经过非致死性缺氧后，对再次遭遇的缺氧产生耐受，从而减轻缺氧对动物或细胞的损伤；所述耐受具体可体现为对相同的缺氧状态的耐受时间延长。
[0007]所述产品还可包含记载有如下内容的载体:
[0008]若所述待测动物或细胞中PSA2蛋白的含量高于(在统计学上显著高于)对照动物或细胞中PSA2蛋白的含量，则所述待测动物或细胞处于缺氧预适应状态或候选处于缺氧预适应状态；反之，则所述待测动物或细胞不处于缺氧预适应状态或候选不处于缺氧预适应状态；
[0009]所述对照动物或细胞为:与所述待测动物或细胞分类命名相同，且未经缺氧处理的正常的动物或细胞。
[0010]进一步，所述PSA2蛋白的含量高于对照动物或细胞中PSA2蛋白的含量，具体可为所述PSA2蛋白的含量为所述对照动物或细胞中PSA2蛋白的含量的1.2倍以上，再如2倍以上。
[0011]所述载体可为纸张，也可为电子信息载体，如U盘、软盘、⑶等。
[0012]在本发明中，所述PSA2蛋白的氨基酸序列具体为序列表中序列I。
[0013]进一步，在本发明中，所述用于检测PSA2蛋白的物质为用于进行双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)的试剂和仪器，具体为如下:
[0014](al)三种荧光染料Cy2、Cy3和Cy5 ；
[0015](a2)等电聚焦电泳仪(如GE公司生产的IEF等电聚焦电泳仪);
[0016](a3)垂直电泳仪(如GE公司生产的垂直电泳仪)；
[0017](a4)突光扫描仪(如GE公司生产的台风Trio扫描仪)；
[0018](a5) 2D图像分析软件(如GE公司生产的DeCyder2D图像分析软件)；
[0019](a6)质谱仪(如布鲁克公司生产的型号为Ultraflex treme T0F/T0F的质谱仪)。
[0020]所述用于检测PSA2蛋白的物质也可为抗所述PSA2蛋白的抗体。
[0021]更进一步，所述鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品，具体可由以上任一所述的用于检测PSA2蛋白的物质，以及以上所述的载体组成。
[0022]另外，所述产品在鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态中的非疾病诊断应用也属于本发明的保护范围。
[0023]用于检测PSA2蛋白的物质在制备用于鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0024]在所述应用中，所述用于检测PSA2蛋白的物质为用于进行双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)的试剂和仪器，具体为如下:
[0025](al)三种荧光染料Cy2、Cy3和Cy5 ；
[0026](a2)等电聚焦电泳仪(如GE公司生产的IEF等电聚焦电泳仪);
[0027](a3)垂直电泳仪(如GE公司生产的垂直电泳仪)；[0028](a4)荧光扫描仪(如GE公司生产的台风Trio扫描仪)；
[0029](a5) 2D图像分析软件(如GE公司生产的DeCyder2D图像分析软件)；
[0030](a6)质谱仪(如布鲁克公司生产的型号为Ultraflex treme T0F/T0F的质谱仪)。
[0031]所述用于检测PSA2蛋白的物质也可为抗所述PSA2蛋白的抗体。
[0032]进一步，所述PSA2蛋白的氨基酸序列具体为序列表中序列I。
[0033]本发明的一个实施例中，具体选择小鼠(如ICR小鼠)作为所述动物，用于检测所述PSA2蛋白的含量，检测部位具体为所述动物(如小鼠)的脑组织。
[0034]本发明结合双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)和质谱对提取液进行全面分析，最终发现PSA2蛋白可作为缺氧预适应的标记物。具体表现为，缺氧预适应后，PSA2蛋白在脑组织中含量明显增加。缺氧预适应生物标志物的揭示将对更加深入的了解缺氧预适应的机制在临床上对缺氧相关疾病做出早期诊断和干预治疗有很大帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为2D-DIGE电泳图。
[0036]图2为PSA2蛋白的一级质谱图与二级质谱图。其中，A为PSA2蛋白一级质谱图。B为m/z2362.1123 二级质谱图。
[0037]图3为PSA2蛋白在对照组与缺氧组中含量变化图。纵轴为PSA2蛋白相对含量的对数值。
【具体实施方式】
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]实施例1、小鼠缺氧预适应动物模型的获得
[0041]将ICR小鼠(雄性，体重18_22g，由首都医科大学实验动物中心提供(动物号:SCXK(京)2012-0001)饲养于清洁室内，实验前禁食12小时不禁水。将9只小鼠随机分成3组，分别为对照组、缺氧3次组和缺氧6次组，每组3只。
[0042]称重后将缺氧3次组和缺氧6次组的小鼠置于125ml的广口瓶中，将瓶口用涂有凡士林的橡胶塞塞紧密封，开始计时(缺氧耐受时间的起点)并观察小鼠的反应。当小鼠出现喘呼吸现象时，记录时间(缺氧耐受时间的终点)。立即将小鼠从瓶中取出，并迅速放入另一个充满新鲜空气的125ml广口瓶中后，立即将瓶口用涂有凡士林的橡胶塞塞紧密封，重新开始下一轮计时，记录该次缺氧处理的缺氧耐受时间。共重复缺氧处理3次或6次。
[0043]小鼠在缺氧3次或6次后立即断头处死，然后在冰上迅速取出小鼠的脑组织，用滤纸将血迹吸干，放到液氮中保存待用。而对照组小鼠不进行缺氧处理，直接断头处死，在冰上迅速取出小鼠的脑组织，用滤纸将血迹吸干，放到液氮中保存待用。
[0044]对缺氧6次组小鼠的缺氧耐受时间与缺氧处理次数之间的关系进行分析，可见小鼠缺氧耐受时间随着缺氧预适应次数的增多而大幅延长，从缺氧第I次的大约15min到缺氧第6次能够延长到约80-90分钟，可见，小鼠对缺氧产生了一定的适应性，即处于缺氧预适应状态。
[0045]实施例2、缺氧预适应生物标记物的发现[0046]一、脑组织样品的处理
[0047]将实施例1获得的各组小鼠的脑组织从液氮中取出置于冰上，称重，按照每克脑组织2.5ml的用量，分别加入组织裂解液【配方:溶剂为水，溶质及其浓度如下:8M尿素，2M硫脲(GE公司产品，其产品目录为:RPN6301)，2% (w/v) CHAPS (GE公司产品，其产品目录为:17-1314-01)】，并加入终浓度为0.005g/ml的蛋白酶抑制剂混合物片(罗氏公司产品，其产品目录号04693159001)，用手持匀浆机于冰上匀浆。超声破碎仪进行细胞粉碎。在冰上静置15分钟。150000rpm，4°C离心60分钟。收集上清。加入三倍体积的冰冷的含有10%(w/v)三氯醋酸的丙酮溶液。置于_20°C过夜沉淀。沉淀结束后，取出样品。15000rpm，4°C离心30分钟。弃上清，加入冰冷的丙酮溶液，15000rpm，4°C离心10分钟。弃上清，再次加入冰冷的丙酮溶液，15000rpm，4°C离心10分钟。将沉淀冻干，得蛋白质干粉，置于_20°C备用。
[0048]二、对步骤一样品进行双向凝胶荧光差异凝胶电泳分析
[0049]1、待测样品溶液的配制
[0050]用含有30mM Tris的水化液【水化液:溶剂为水，溶质及其浓度如下:8M尿素，2M硫脲(GE公司产品，其产品目录为:RPN6301)，2% (w/v) CHAPS (GE公司产品，其产品目录为:17-1314-01),0.002% (w/v)溴酚蓝】。将蛋白质干粉充分溶解，并且用IM HCl或IM NaOH精确调pH至8.0-8.5。
[0051]2、蛋白定量
[0052]采用GE公司生产的2-Quant蛋白定量试剂盒(产品目录号为80_6483_56)，对步骤I配制的待测样品溶液进行蛋白定量。具体操作如下:
[0053]在定量实验开始之前，先按要求配好preliminary color reagent溶液25ml,将试剂盒中的A液与B液按照100:1 (体积比)的比例混合均匀备用。向EP管中加入I μ 1、5 μ 1、10 μ 1、15 μ I和20 μ I浓度为2 μ g/μ I的BSA标准液，每个浓度重复3次，作为制作标准曲线的样品。将溶解好的小鼠脑蛋白样品(即步骤I配制的待测样品溶液)取2-3 μ 1，加入空白EP管中。向每个EP管中加入500 μ I precipitant溶液。颠倒混匀后室温下静置2-3分钟,然后加入co-precipitant溶液500 μ I。颠倒混匀后1000Og离心5分钟。从没有白色沉淀的一侧吸净上清，洗净上清并确保没有液体残留。上清弃掉之后，每管中加入100 μ I copper solution和400 μ I纯水，颠倒混匀。加入1ml事先配制好的preliminarycolor reagent溶液,颠倒混匀。于室温下孵育15-20分钟。用分光光度测定波长为480nm处的戏光值。根据测得的数值，做出标准曲线。并根据样品的吸光值以及体积，用公式算出样品的蛋白质含量。
[0054]3、2D_DIGE 检测
[0055](I)标记蛋白样品
[0056]采用最小标记法标记蛋白。具体操作如下:
[0057]用Iml的注射器吸取二甲基甲酰胺(DMF)，冲洗针管及600 μ I Ep管。再取出一定量DMF放入冲洗好的EP管中备用。
[0058]从荧光染料试剂盒(GE公司产品，其产品目录号为25-8010-65)中取出三种染料:Cy2、Cy3 和 Cy5。
[0059]配制染料母液(浓度为1mmol/ μ I):每管染料(5mmol)加入5 μ I DMF,涡轮混匀，1000Og 离心 30s。
[0060]配制染料工作液:0.6μ I DMF加入0.4μ I染料母液配制1μ I工作液，可用来标记50 μ g蛋白质。
[0061]对蛋白样品进行标记:按照表1对各蛋白样品进行标记，将各个待标记的蛋白样品与染料混合，进行涡旋混匀，4°C离心，避光，在冰上孵育30min。向IS管内加入3 μ IlOmM赖氨酸，其余各管中分别加入I μ I赖氨酸,于冰上孵育lOmin，终止标记。
[0062]表12D-DIGE中对蛋白样品的标记
【权利要求】
1.鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品，包含用于检测PSA2蛋白的物质。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于:所述产品还包含记载有如下内容的载体: 若所述待测动物或细胞中PSA2蛋白的含量高于对照动物或细胞中PSA2蛋白的含量，则所述待测动物或细胞处于缺氧预适应状态或候选处于缺氧预适应状态；反之，则所述待测动物或细胞不处于缺氧预适应状态后候选不处于缺氧预适应状态； 所述对照动物或细胞为:与所述待测动物或细胞分类命名相同，且未经缺氧处理的正常的动物或细胞。
3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于:所述PSA2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I。
4.根据权利要求1-3中任一所述的产品，其特征在于:所述用于检测PSA2蛋白的物质为如下: (al)三种荧光染料Cy2、Cy3和Cy5 ； (a2)等电聚焦电泳仪； (a3)垂直电泳仪； (a4)突光扫描仪； (a5)2D图像分析软件； (a6)质谱仪。
5.根据权利要求1-3中任一所述的产品，其特征在于:所述用于检测PSA2蛋白的物质为抗所述PSA2蛋白的抗体。
6.权利要求1-5中任一所述的产品在鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态中的非疾病诊断应用。
7.用于检测PSA2蛋白的物质在制备用于鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述用于检测PSA2蛋白的物质为如下: (al)三种荧光染料Cy2、Cy3和Cy5 ； (a2)等电聚焦电泳仪； (a3)垂直电泳仪； (a4)突光扫描仪； (a5)2D图像分析软件； (a6)质谱仪。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述用于检测PSA2蛋白的物质为抗所述PSA2蛋白的抗体。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于:所述PSA2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I。
【文档编号】G01N21/64GK103954597SQ201410179074
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】薛明, 崔灿, 徐平湘, 白露 申请人:首都医科大学