基于l-精氨酸改良的细胞内一氧化氮含量变化的检测方法
【专利摘要】一种基于L-精氨酸改良的细胞内一氧化氮NO合成量变化的检测方法，通过将培养后的细胞置于暴露液后，经裂解处理后通过一氧化氮检测试剂盒检测细胞吸光度，并进一步折算得到细胞内NO的合成量的变化。本发明灵敏度高、选择性好、操作简便快捷、不依赖大型仪器设备。
【专利说明】基于L-精氨酸改良的细胞内一氧化氮含量变化的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物检测【技术领域】的方法，具体是一种基于L -精氨酸改良的细胞内一氧化氮含量变化的检测方法。
【背景技术】
[0002]一氧化氮(NO)是一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)催化氧气和L -精氨酸生成的产物。NOS是一类同功酶的总称，单体形式的NOS通过很多辅助因子的作用形成同源二聚体，产生催化活性，才能最终生成NO。由于NO是一种可溶性气体，作为信号分子，穿透能力强，传导速度快，参与体内众多的生理和病理过程，在体内担任重要的生理调节作用。研究表明NO的生物学效应具有双重性，在正常条件下作为体内的快速信号传导物质具有重要的生物学意义，比如舒张血管、神经传导。在氧化胁迫的研究中，NO具有保护细胞、防止细胞凋亡的作用。但另一方面，同时又有报道NO参与氧化胁迫促使细胞凋亡。由于，生物系统内的NO合成量通常都比较低，常规方法较难反映待测物暴露后，生物系统内NO合成量的变化。因此，为了方便研究NO在体内各系统中的生物学效应及环境污染物对生物系统内的NOS信号通路及NO合成的影响，建立一种简单、快速、高灵敏度的细胞内NO合成量检测方法在研究中就显得尤为重要。
【发明内容】
[0003]本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于L-精氨酸改良的细胞内一氧化氮NO合成量变化的检测方法，以L -精氨酸是NOS催化生成NO的底物，本发明操作简单快速、灵敏度高，能够快速实现细胞内的NO合成量检测。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将培养后的细胞置于暴露液后，经裂解处理后通过一氧化氮检测试剂盒检测细胞吸光度，并进一步折算得到细胞内NO的合成量的变化。
[0005]所述的细胞是指:人乳腺癌MCF - 7细胞；
[0006]所述的培养是将MCF - 7细胞培养于细胞培养液并置于37°C、5% CO2培养箱中进行培养。
[0007]所述的细胞培养液的组分为:100 μ L/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素、10% v/v胎牛血清，余量为高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumDMEM/HIGH Glucose, Hyclone)。
[0008]所述的胎牛血清品牌为四季青，购自浙江天杭生物科技有限公司。
[0009]所述的暴露液是指:
[0010]I)含IOmML -精氨酸的细胞培养液，即暴露液I ;
[0011]2)含ImM氯化铜以及IOmM L -精氨酸的细胞培养液，即暴露液2 ；
[0012]3)以及用于对比比照的细胞培养液，即对比液。[0013]所述的暴露液通过在暴露前用含IOmM L -精氨酸的培养液预处理Ih实现。
[0014]所述的暴露的持续时间为30min。
[0015]所述的裂解是指:向待测对象中加如200 μ L的细胞裂解液(2 %NP - 40, 80mMNaCl, IOOmM Tris - HCl)，以12，OOOrpm的环境下离心处理3min后取出上清液
进行NO合成量测定。
[0016]所述的一氧化氮检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。
[0017]所述的吸光度是指:取50 μ L各暴露液处理后的细胞裂解上清液各加50μ L的Griess Reagent I和II,检测其位于540nm下的吸光度。
[0018]所述的折算是指:A= A=㈢，其中人为细胞培养液对照吸光度，A1为
暴露液I处理后细胞裂解上清液中的吸光度，A2为暴露液2处理后细胞裂解上清液中的吸光度，B为背景值，即50 μ L细胞裂解液不经暴露直接加50 μ L的Griess Reagent I和II测得的吸光度。
[0019]本方法提出的加入L -精氨酸处理后，氯化铜暴露后细胞内NO合成量的变化=
x「x2。
技术效果
[0020]与现有技术相比，本发明采用添加L -精氨酸的方法，利用人乳腺癌MCF - 7细胞，简单、快速、高灵敏度检测细胞内NO合成量的变化，其主要特点和优势有:该方法操作简单、快速。L -精氨酸处理可以放大细胞内NO合成量的变化，提高整个体系的灵敏度，从而能更加直接、灵敏地反映出受试物对NO合成量及NOS信号通路的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为实施例中氯化铜(Cu)和L -精氨酸(L -Arg)处理后细胞内NO合成量变化示意图；
[0022]图中:同组内(对照和加L - Arg)的NO相对合成量存在显著性差异(ρ〈0.01)的用不同的大写字母(Α、B)表示，不同组对照之间、加L - Arg之间的NO相对合成量存在显著性差异(ρ〈0.01)的用不同的小写字母(a、b)表示。
【具体实施方式】
[0023]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0024]本实施例待测物:一氧化氮；模式生物:人乳腺癌MCF - 7细胞；试剂:L -精氨酸(sigma)、氯化铜(标准品溶于无菌水配制成0.lmol/L母液并于_20°C保存，实验前用培养液稀释至所需浓度)、一氧化氮检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，江苏)。
[0025]本实施例具体步骤如下:
[0026]I)人乳腺癌MCF - 7细胞的培养:细胞在37°C、5% CO2培养箱中培养。细胞培养液成分为:高糖达尔伯克改良伊格尔培养基Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM/HIGH Glucose, Hyclone),添加lOOu/mL青霉素,100 μ g/mL链霉素，10 %四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。实验前细胞接种于35mm培养皿，24h，贴壁。
[0027]2)暴露液成分:
【权利要求】
1.一种基于L -精氨酸改良的细胞内NO合成量变化的检测方法，其特征在于，通过将培养后的细胞置于暴露液后，经裂解处理后通过一氧化氮检测试剂盒检测细胞吸光度，并进一步折算得到细胞内NO的合成量的变化； 所述的暴露液是指: 1)含IOmML-精氨酸的细胞培养液，即暴露液I ; 2)含ImM氯化铜以及IOmML -精氨酸的细胞培养液，即暴露液2 ； 3)以及用于对比比照的细胞培养液，即对比液； 所述的折算是指
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的培养是将人乳腺癌MCF- 7细胞培养于细胞培养液并置于37°C、5% CO2培养箱中进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的细胞培养液的组分为:100μ L/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素、10% v/v胎牛血清，余量为高糖达尔伯克改良伊格尔培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的暴露液通过在暴露前用含IOmML-精氨酸的培养液预处理Ih实现。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的暴露的持续时间为30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的裂解是指:向待测对象中加如200μ L的细胞裂解液2% NP - 40, 80mMNaCl, IOOmM Tris - HCl,以12，OOOrpm的环境下离心处理3min后取出上清液进行NO合成量测定。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的吸光度是指:取50μ L各暴露液处理后的细胞裂解上清液各加50μ L的Griess Reagent I和II，检测其位于540nm下的吸光度。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的背景值是指:50μL细胞裂解液不经暴露直接加50 μ L的Griess Reagent I和II测得的吸光度。
【文档编号】G01N21/31GK103954571SQ201410182084
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月2日 优先权日:2014年5月2日
【发明者】陆伟, 周培, 钟玲盈 申请人:上海交通大学