一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法
【专利摘要】本发明公开了一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，待测样品中的碱性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和无机磷酸盐，5-溴-4-氯-3-吲哚还原尼罗蓝A，降低尼罗蓝A的SERS强度，间接检测碱性磷酸酶。本发明与光密度检测或光强度检测的ALP活性检测方法相比，本发明基于SERS的超灵敏检测能够在更低浓度的水平上检测碱性磷酸酶；与现有的碱性磷酸酶SERS检测方法相比，本发明检测的是尼罗蓝A分子(NBA)分子的SERS信号，尼罗蓝A分子的内在拉曼活性比有的碱性磷酸酶SERS检测方法中BCIP产物的高，有利于进一步提高分析灵敏度。
【专利说明】一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶活性检测的【技术领域】，更具体地，涉及一种基于表面增强拉曼检测技术建立的超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法。
【背景技术】
[0002]碱性磷酸酶(ALP)是一种水解酶，从生物分子除去磷酸基团发挥生物效应，参与能量代谢、信号转导等生命活动，在其活性或含量的变化将指示生理和病理演变等生化反应。因此，检测体液中ALP可以诊断多种疾病。此外，ALP也用作标记试剂为生物学研究。当它是作为酶免疫标记试剂，相较于辣根过氧化物酶，ALP具有高稳定性，高灵敏度的优点。它也被用来作为基因表达研究一个量化指标。发展一种超灵敏的ALP活性的检测方法对于上述的研究是十分重要的。目前，碱性磷酸酶(ALP)的活性通过测定有色产物的光密度或产品的发出的荧光或化学发光强度来检测。方法的检出限分别为500 μ U/L和20 μ U/L。
[0003]表面增强拉曼散射(SERS)技术是超灵敏的检测的有力工具。在实际应用中，强SERS信号总是从对SERS材料具有高亲和力和高的内在拉曼活性的分子获得。许多策略已经被开发用于那些对SERS材料亲和力低或拉曼活性低的分子。在SERS检测酶的活性研究中，当酶的底物和产物不能提供强的SERS信号时，合成带有染料的替代底物是一种有效的方法。
[0004]5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)是检测ALP活性中常用的商品化显色底物，并将其转化为5-溴-4-氯-3-吲哚(BCI)和无机磷酸盐。在免疫印迹法、原位杂交和免疫组织化学研究中，产生的BCI可以还原氮蓝四唑(NBT)，以形成不溶性有色沉淀物，以指示ALP的存在。虽然ALP的SERS检测方法已开发通过收集BCI 二聚体的SERS信号，但本发明中，尼罗蓝A(NBA)是一种具有较强的内在拉曼活性的分子，可建立ALP的超灵敏SERS检测方法。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼检测技术建立的超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，具有操作简便的特点。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现:一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，待测样品中的碱性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和无机磷酸盐，5-溴-4-氯-3-吲哚还原尼罗蓝Α，降低尼罗蓝A的SERS强度，间接检测碱性磷酸酶。
[0007]本发明将尼罗蓝A分子(NBA)和5-溴_4_氯_3_吲哚磷酸作为ALP的底物，通过检测反应体系中尼罗蓝A分子(NBA)的SERS光谱的一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法。
[0008]具体包括以下步骤:
[0009]I)将含有碱性磷酸酶的待测样品用含MgCl2和NaCl的ρΗ9.5的tris-HCl缓冲溶液稀释1-10000倍得到溶液；[0010]2)将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼罗蓝A分子水溶液加入步骤I)溶液中，再在37 V温育30分钟，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始浓度为I X 10—3-1 X 10_6mOl/L，所述的尼罗蓝A分子水溶液在溶液中的初始浓度为lXl(T4-lXl(T9mol/L ；
[0011]3)将SERS活性材料加入步骤2)得到的溶液中，5分钟后测定SERS信号。
[0012]其中，上述MgCl2在tris-HCl缓冲溶液中的浓度为0.l-50mmol/L，所述NaCl在tris-HCl缓冲溶液中的浓度为I O-1 OOOmmo I/L。
[0013]其中，上述tris-HCl缓冲溶液的浓度为l-lOOOmmol/L。
[0014]其中，上述SERS活性材料为金纳米粒子悬浮液、银纳米粒子悬浮液、金银复合的纳米粒子悬浮液、金银与无机或有机材料复合的纳米粒子悬浮液或集成在固相基底上形成的纳米材料中的一种。
[0015]其中，上述的金银与无机材料复合的纳米粒子悬浮液是硅或二氧化硅为核的金壳或银壳悬浮液；所述的金银与有机材料复合的纳米粒子悬浮液是聚苯乙烯为核的金壳或银壳悬浮液；所述的集成在固相基底纳米材料是上述任意一种或几种纳米粒子悬浮液吸附到载玻片或针灸针上形成的固相基底纳米材料。
[0016]有益效果:与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0017](I)本发明与光密度检测或光强度检测的ALP活性检测方法相比，本发明基于SERS的超灵敏检测能够在更低浓度的水平上检测碱性磷酸酶。
[0018](2)与现有的碱性磷酸酶SERS检测方法相比，本发明检测的是尼罗蓝A分子(NBA)分子的SERS信号，尼罗蓝A分子的内在拉曼活性比有的碱性磷酸酶SERS检测方法中BCIP产物的高，有利于进一步提高分析灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明检测的原理示意图。
[0020]图2是基于一种固相SERS基底检测碱性磷酸酶的标准曲线。
【具体实施方式】
[0021 ] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0022]实施例1纯碱性磷酸酶的SERS检测
[0023]纯酶用含5mmol/L 的 MgCl2 和 100mmol/L 的 NaCl 的 tris-HCl 缓冲溶液(ρΗ9.5)稀释至l、10、100、1000、10000mU/L ;BCIP水溶液和尼罗蓝A分子(NBA)水溶液加入上述溶液中，再在37°C温育30分钟后，其中tris-HCl缓冲溶液(pH9.5)的浓度为lmmol/L ；BCIP水溶液在溶液中的初始浓度为4.5X10_4mOl/L，尼罗蓝A分子(NBA)水溶液在溶液中的初始浓度为4X 10_6mol/L ;将集成SERS活性材料的载玻片浸入上述溶液，5分钟后测定SERS信号，根据592CHT1处的SERS强度和对应的碱性磷酸酶的量绘制标准曲线(见图2)。得到线性方程:Y = 11.6397Χ+33413.429。SERS活性材料为金银复合的纳米粒子悬浮液。
[0024]实施例2:血液中碱性磷酸酶的SERS检测
[0025]将血液用含5mmol/L的MgCl2和100mmol/L的含NaCl的tris-HCl缓冲溶液(pH9.5)稀释至1、10、100、1000、10000倍；其中tris-HCl缓冲溶液(ρΗ9.5)的浓度为IOmmoI/L ;BCIP水溶液和尼罗蓝A分子(NBA)水溶液加入上述溶液中，再在37°C温育30分钟后，其中，所述的BCIP水溶液在溶液中的初始浓度为4.5X10_4mol/L，所述的尼罗蓝A分子(NBA)水溶液在溶液中的初始浓度为4X 10_6mOl/L ;将集成SERS活性材料的载玻片浸入上述溶液，5分钟后测定SERS信号，SERS活性材料为金银与二氧化硅复合的，以二氧化硅为核的纳米粒子悬浮液。其中稀释10倍的SERS强度是1.03X 105。可根据实施例1的标准曲线计算具体的酶含量约为119.98U/L。
[0026]实施例3:血液中磷酸酶的SERS检测
[0027]将血液用含0.lmmol/L 的 MgCl2 和 10mmol/L 含 NaCl 的 ρΗ9.5 的 tris-HCl 缓冲溶液稀释至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl缓冲溶液(pH9.5)的浓度为20mmol/L ;将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼罗蓝A分子水溶液加入上述溶液中，再在37°C温育30分钟，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始浓度为I X 10_3mol/L，所述的尼罗蓝A分子水溶液在溶液中的初始浓度为I X 10_4mol/L ;将SERS活性材料加入得到的溶液中，5分钟后测定SERS信号。SERS活性材料为聚苯乙烯为核的金壳纳米粒子悬浮液。其中稀释10倍的SERS强度8.2X 104。可根据实施例1的标准曲线计算具体的酶含量约为 493.45U/L。
[0028]实施例4血液中磷酸酶的SERS检测
[0029]I)将血液用含 25mmol/L 的 MgCl2 和 500mmol/L 的 NaCl 的 ρΗ9.5 的 tris-HCl 缓冲溶液稀释至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl缓冲溶液(pH9.5)的浓度为500mmol/L ；2)将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼罗蓝A分子水溶液加入步骤I)溶液中，再在37°C温育30分钟，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始浓度为
0.5X10_3mol/L，尼罗蓝A分子水溶液在溶液中的初始浓度为0.5X10_4mol/L ；3)将SERS活性材料加入步骤2)得到的溶液中，5分钟后测定SERS信号。SERS活性材料为银纳米粒子悬浮液吸附到载玻片上形成的固相基底纳米材料。其中稀释10倍的SERS强度4.5X 104。可根据实施例1的标准曲线计算具体的酶含量约为31.65U/L。
[0030]实施例5血液中磷酸酶的SERS检测
[0031]I)将血液用含 50mmol/L 的 MgCl2 和 1000mmol/L 的 NaCl 的 pH9.5 的 tris-HCl 缓冲溶液稀释至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl缓冲溶液(ρΗ9.5)的浓度为lOOOmmol/L ；2)将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼罗蓝A分子水溶液加入步骤I)溶液中，再在37°C温育30分钟，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始浓度为1父10_611101/1，尼罗蓝六分子水溶液在溶液中的初始浓度为1\10_911101/1 ；3)将SERS活性材料加入步骤2)得到的溶液中，5分钟后测定SERS信号。SERS活性材料为金银与二氧化硅复合的，以二氧化硅为核的纳米粒子悬浮液吸附到针灸针上形成的固相基底纳米材料。其中稀释10倍的SERS强度是8.6X 104。可根据实施例1的标准曲线计算具体的酶含量约为498.8U/L。
【权利要求】
1.一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，其特征在于，待测样品中的碱性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和无机磷酸盐，5-溴-4-氯-3-吲哚还原尼罗蓝A，降低尼罗蓝A的SERS强度，间接检测碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 1)将含有碱性磷酸酶的待测样品用含MgCl2和NaCl的pH9.5的tris_HCl缓冲溶液稀释1-10000倍得到溶液； 2)将5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼罗蓝A分子水溶液加入步骤I)溶液中，再在37 °C温育30分钟，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始浓度为I X 10—3-1 X 10_6mOl/L，所述的尼罗蓝A分子水溶液在溶液中的初始浓度为lXl(T4-lXl(T9mol/L ； 3)将SERS活性材料加入步骤2)得到的溶液中，5分钟后测定SERS信号。
3.根据权利要求2所述的一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，其特征在于，所述MgCl2在tris-HCl缓冲溶液中的浓度为0.l-50mmol/L，所述NaCl在tris_HCl缓冲溶液中的浓度为 10-1000mmol/L。
4.根据权利要求2所述的一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，其特征在于，所述tris-HCl缓冲溶液的浓度为l-1000mmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，其特征在于，所述SERS活性材料为金纳米粒子悬浮液、银纳米粒子悬浮液、金银复合的纳米粒子悬浮液、金银与无机或有机材料复合的纳米粒子悬浮液或集成在固相基底上形成的纳米材料中的一种。
【文档编号】G01N1/38GK103969436SQ201410194039
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】董健, 李媛, 张明月, 郝振宇, 朱珠, 张里, 钱卫平 申请人:东南大学