检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用，该制备方法是将酪氨酸酶和过氧化物酶固定到氧化石墨烯上得到共固定酶液，然后将共固定酶液和壳聚糖溶液依次滴涂在玻碳电极表面，得到检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极，该电极成本低、操作简便、快速、灵敏、检测限低、选择性好，可以用于环境中微量对苯二酚和邻苯二酚的检测。
【专利说明】检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境检测领域，具体涉及一种检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]邻苯二酌.(Catechol, CC)和对苯二酌.(Hydroquinone, HQ)作为重要的化工原料，被广泛用于橡胶防老化剂、照相显影剂和香料、农药、医药、染料等领域，其毒性比普通酚类污染物大，即使在极低的浓度下，HQ和CC对动物、植物和水生环境也是极其有害的。为了评价由于HQ和CC暴露而对实际人体健康造成的风险，就需要在极低的浓度水平下得到它们在环境中准确的浓度数据。因此，开发一种简单而敏感地检测微量HQ和CC的分析方法就具有重大的意义。
[0003]近年来，不同类型的化学分析方法被应用于HQ和CC的检测。国内外常采用的检测HQ和CC的方法包括高效液相色谱法，紫外-可见分光光度法，荧光分光光度法，毛细管电泳法等。这些方法尽管准确且具有较低检测限，但是需要昂贵且复杂的仪器，且不能实现在线和实时监控。电化学传感器因其响应速度快，易于小型化，成本低，省时，高灵敏度，优异的选择性以及在线实时检测等特点而受到广泛关注。
[0004]目前已经有一些电化学传感器用来检测HQ和CC，如将羧基化的多壁碳纳米管修饰到玻碳电极表面，该电极对HQ和CC的检测限分别为ΙΟμΜ和8μΜ(李明齐，何晓英，蔡铎昌，碳纳米管修饰电极对对苯二酚和邻苯二酚的电催化研究，分析科学学报，2006.03 (22):299-304);以谷氨酸单体为初始试剂，利用电化学聚合方法制备得到聚谷氨酸修饰电极，该电极对HQ和CC的检测限和线性范围分别为ImM和5-100 μ M (王春燕，由天艳，田坚，聚谷氨酸修饰电极同时检测对苯二酚和邻苯二酚，分析化学研究报告，2011.04(39):528-533)。这些电极均能检测HQ和CC，然而它们的检测限都比较高，无法对环境中微量的污染物进行灵敏性检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极其制备方法及应用，该电极具有成本低、操作简便、快速、灵敏、检测限低、选择性好等优点，可以用于环境中微量对苯二酚和邻苯二酚的检测。
[0006]检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，包括以下步骤:
[0007]步骤I，将氧化石墨烯在浓硫酸和硝酸混合液中搅拌1-2小时，再放入浓盐酸中超声1-2小时，过滤并用去离子水清洗，室温干燥，得羧基化氧化石墨烯；
[0008]氧化石墨烯与混合酸液的重量体积比为5-15mg: 20_60mL，浓硫酸与硝酸体积比为2:1-4:1 ；
[0009]
【权利要求】
1.检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，包括以下步骤: 步骤1，将氧化石墨烯在浓硫酸和硝酸的混合酸液中搅拌1-2小时，再放入浓盐酸中超声1-2小时，过滤并用去离子水清洗，室温干燥，得羧基化氧化石墨烯； 氧化石墨烯与混合酸液的重量体积比为5-15 mg:20-60 mL，浓硫酸与硝酸体积比为2:1-4:1 ； 步骤2，将步骤I所得羧基化氧化石墨烯加入氯化亚砜和N，N- 二甲基甲酰胺的混合溶液中，60-80°C水浴搅拌12-48h，过滤，用无水四氢呋喃清洗，室温下真空干燥，得酰氯化氧化石墨烯； 羧基化氧化石墨烯与混合溶液的重量体积比为5-15 mg:50-150 mL,氯化亚砜和N, N-二甲基甲酰胺的体积比为10:1-30:1 ； 步骤3，将步骤2所得酰氯化氧化石墨烯加入乙二胺中，搅拌12-48h，过滤，室温下真空干燥，得氨基化氧化石墨烯； 酰氯化氧化石墨烯与乙二胺的重量体积比为5-15 mg:20-60 mL ； 步骤4，将步骤3所得氨基化氧化石墨烯加入pH为6.0-7.0的缓冲溶液中，超声分散20-40 min，得到质量浓度为l_3mg/mL的石墨烯分散液； 步骤5，取100-300 μ L步骤 4所得石墨烯分散液与质量分数为2%-10%的戊二醛反应，超声20-40 min后在摇床上摇动l_3h，得到溶液体系，备用； 石墨烯分散液与戍二醒的体积比为0.5-1.5:1 ； 步骤6，在步骤5所得溶液体系中加入100-300 μ L酪氨酸酶溶液和过氧化物酶溶液的混合酶液，反应l_3h，得到共固定酶液； 混合酶液中酪氨酸酶溶液与过氧化物酶溶液的体积比为1:1-2:1，酪氨酸酶溶液与过氧化物酶溶液的浓度都是2-10mg/mL，溶剂是pH为6.0-7.0的缓冲溶液； 步骤7，移取步骤6的共固定酶液滴涂于活化处理后的玻碳电极上，滴涂量为5-20 μ L，4°C干燥，再移取质量分数为0.2-1.0%的壳聚糖溶液滴涂于玻碳电极上；干燥后即得检测对苯二酹和邻苯二酹的共固定酶电极； 共固定酶液与壳聚糖溶液的体积比为1:1-3:1。
2.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤I中氧化石墨烯与混合酸液的重量体积比为10 mg:40 mL，浓硫酸与硝酸体积比为3:1，搅拌时间为1.5小时，在浓盐酸中超声的时间为1.5小时。
3.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤2中羧基化氧化石墨烯与混合溶液的重量体积比为10 mg: 100 mL，羧基化氧化石墨烯加入混合溶液70°C水浴搅拌24h，氯化亚砜和N，N- 二甲基甲酰胺的体积比为20:1。
4.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤3中酰氯化氧化石墨烯与乙二胺重量体积比为10 mg:40 mL，搅拌反应时间为24h。
5.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤4中超声分散的时间为30min,所得石墨烯分散液的浓度为2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤5中石墨烯分散液的加入量为200yL，石墨烯分散液与戊二醛体积比为1:1，戊二醛的质量分数为5%，超声时间为30min，反应时间为2h。
7.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤6中酶混合液的加入量为200 μ L，反应时间为2h，混合酶液中酪氨酸酶溶液与过氧化物酶溶液的体积比为1.5:1，酪氨酸酶溶液与过氧化物酶溶液的浓度都是5mg/mL。
8.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤7中共固定酶液滴涂量为10 μ L，壳聚糖溶液的质量分数为0.5%，共固定酶液与壳聚糖溶液的体积比为2:1。
9.根据权利要求1所述的检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法，其特征在于:步骤7所述活化处理的玻碳电极是由如下方法制得:在电化学工作站中，Ag/AgCl作参比电极，钼电极作对电极，玻碳电极作工作电极，采用循环伏安法扫描酸溶液，循环伏安扫描酸液的电位范围为-1.0-1.0 V，扫描速率为50-150 mV/s,扫描圈数为10-30圈；所述酸溶液为硫酸、硝酸 或盐酸，其浓度为0.1-1 M0
【文档编号】G01N27/327GK104007156SQ201410210210
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】华祖林, 白雪, 王超凡, 黄欣, 秦琴, 张琪, 张晓媛, 马文强, 顾海鑫, 戴章艳 申请人:河海大学