被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法
【专利摘要】本发明公开了被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将处理后的被子植物花部器官在含有Mitotracker?Red?CMXRos的缓冲液中染色，实现荧光标记被子植物花部器官线粒体。本发明的实验证明，本发明提供了一种被子植物花被片线粒体荧光标记的方法，有以下优点：1)标记效果好，可在激光共聚焦显微镜下观察到线粒体均匀的分布在细胞周围；2)用Mitotracker标记后的装片经固定液固定后，可制成永久制片观察；3)简单、快捷并迅速的标记花部器官中的线粒体；为花部器官线粒体分布及位移的研究奠定基础，实际应用价值高。
【专利说明】被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及被子植物花部器官的线粒体荧光标记方法。【背景技术】
[0002]花作为植物的繁殖器官，由萼片、花瓣、雄蕊群和雌蕊群组成，承担植物传粉、受精及结实的全部过程，因此成为植物学领域研究的重点对象。植物为响应外界环境变化，进化出多种响应机制，如植物的开花生热，自交不亲和现象，花柱引导组织分泌物质引导花粉管生长的等机制，对保证植物的生殖过程起着至关重要的作用。线粒体作为能量代谢的重要细胞器，能够响应细胞事件，进行运动及位移。花部器官为生殖生长的重要场所，代谢活动旺盛，是研究线粒体分布，位移的重要部位。
[0003]目前，对于线粒体分布，运动及位移的研究集中在根尖、裸子植物花粉管和叶片上表皮等部位。研究对象也均为拟南芥、洋葱及烟草等模式生物。迄今为止，在非模式生物花部器官中线粒体的荧光标记未见报道，从而导致对花部器官线粒体的研究比较滞后。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种被子植物花部器官线粒体的荧光标记方法。
[0005]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0006]将处理后的被子植物花部器官在含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中染色，实现荧光标记被子植物花部器官线粒体。
[0007]上述方法中，MitotrackerRed CMXRos 购于 Molecular Probes,产品目录号M7512，其分子式为C32H32Cl2N2O,化学结构式为式I所示:
[0008]
CH2Cl
[0009]式I。
[0010]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker RedCMXRos 的终浓度为 50nM-200nM。
[0011]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液中Mitotracker RedCMXRos 的终浓度为 50nM、IOOnM 或 200nM Jitotracker Red CMXRos 染色浓度在 50nM_200nM之间均可，但以染色浓度为IOOnM最佳。Mitotracker浓度为200nM，花被片细胞易发生质壁分离。由于花柱切片并非单层细胞，所以染色浓度可为200nM，并适当延长染色时间，质壁分离现象不明显，染色效果好，花柱切片的最佳染色时间为20min。
[0012]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液由Mitotracker RedCMXRos、蔗糖、硼酸和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为50nM、100nM或200nM,所述鹿糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2%,所述硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01% ；
[0013]对于质壁分离严重的植物材料，可用蒸馏水代替缓冲液，但会一定程度上影响线粒体活性；所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液可以由Mitotracker Red CMXRos和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为50nM、IOOnM或200nM。
[0014]上述方法中，所述含有Mitotracker Red CMXRos的缓冲液的pH值为6.5-7.0。
[0015]上述方法中，所述染色的温度为23-28°C，所述染色的时间为15-20min。花被片最佳染色时间为15_17min，时间过短，不容易成功标记，而时间过长，细胞壁易被染成厚重红色，不易观察。
[0016]所述染色的时间具体为15min、17min或20min。
[0017]上述方法中，所述被子植物花部器官为花被片或雌蕊，所述雌蕊具体为花柱。
[0018]上述方法中，所述处理后的花被片按照如下方法制备:收集花被片上表皮细胞，得到处理后的花被片；
[0019]所述处理后的花柱按照如下方法制备:将花柱切片，得到处理后的花柱。
[0020]上述方法中，所述花被片上表皮细胞为单层细胞，且其面积为3.5-4.5mm2，其面积具体为4mm2 ；
[0021 ] 所述花柱切片的厚度为75-85 μ m,其厚度具体为80 μ m。
[0022]上述方法中，所述花柱切片用Leica VT12000S震荡切片机进行纵切，且刀片与花柱保持20-30°夹角，也可以徒手用刀片纵切，只要花柱切片的厚度为75-85 μ m即可。
[0023]上述方法中，所述被子植物为白玉兰或杜鹃。
[0024]上述荧光标记后用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜观察线粒体荧光标记，激发波长为540nm，接收波长范围为570_630nm。花被片染色后用63X水镜观察，花柱用40X物镜观察。应用激光共聚焦显微镜的xyt模式，可以记录细胞内线粒体的动态过程。
[0025]上述方法中，还包括洗涤花部器官的步骤，均采用2%蔗糖和0.01%硼酸组成的缓冲液。
[0026]本发明的实验证明，本发明提供了 一种被子植物花被片线粒体荧光标记的方法，有以下优点:1)标记效果好，可在激光共聚焦显微镜下观察到线粒体均匀的分布在细胞周围；2)用Mitotracker标记后的装片经固定液固定后,可制成永久制片观察；3)简单、快捷并迅速的标记花部器官中的线粒体；为花部器官线粒体分布及位移的研究奠定基础，实际应用价值高。
[0027]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为在激光共聚焦显微镜下观察到的白玉兰花被片上表皮线粒体的分布状态
[0029]图2为在激光共聚焦显微镜下观察到的白玉兰雌蕊薄层细胞线粒体分布状态[0030]图3为在激光共聚焦显微镜下观察到的杜鹃花花柱徒手切片线粒体分布状态【具体实施方式】
[0031]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]Mitotracker Red CMXRos购于Molecular Probes,产品目录号M7512,其分子式为C32H32Cl2N2O,化学结构式为式I所示:
[0034]
【权利要求】
1.一种被子植物花部器官线粒体的荧光标记方法，包括如下步骤: 将处理后的被子植物花部器官在含有MitOtracker Red CMXRos的缓冲液中染色，实现荧光标记被子植物花部器官线粒体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述含有MitotrackerRed CMXRos的缓冲液中 Mitotracker Red CMXRos 的终浓度为 50nM_200nM。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述含有MitotrackerRed CMXRos的缓冲液中 Mitotracker Red CMXRos 的终浓度为 50nM、IOOnM 或 200nM。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述 Mitotracker Red CMXRos 的缓冲液由 Mitotracker Red CMXRos、鹿糖、硼酸和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为IOOnM,所述鹿糖在所述缓冲液中的质量百分含量为2%，所述硼酸在所述缓冲液中的质量百分含量为0.01% ; 或所述 Mitotracker Red CMXRos 的缓冲液由 Mitotracker Red CMXRos 和水组成，所述Mitotracker Red CMXRos在所述缓冲液中的终浓度为ΙΟΟηΜ。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述含有MitotrackerRedCMXRos的缓冲液的pH值为6.5-7.0。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述染色的温度为23-28°C，所述染色的时间为15-20min。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述被子植物花部器官为花被片或雌蕊，所述雌蕊具体为花柱。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于: 所述处理后的花被片按照如下方法制备:收集花被片上表皮细胞，得到处理后的花被片; 所述处理后的花柱按照如下方法制备:将花柱切片，得到处理后的花柱。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于: 所述花被片上表皮细胞为单层细胞，且其面积为3.5-4.5mm2，其面积具体为4mm2 ； 所述花柱切片的厚度为75-85 μ m,其厚度具体为80 μ m。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述花柱切片用Leica VT12000S震荡切片机进行纵切，且刀片与花柱保持20-30°夹角；所述被子植物为白玉兰或杜鹃。
【文档编号】G01N21/64GK103983496SQ201410211027
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】王若涵, 张出兰, 张志翔, 纪翔宇, 刘翔宇 申请人:北京林业大学