一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述试剂盒中包括：（1）鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；（2）标准阳性血清；（3）标准阴性血清；（4）稀释液；并提供了其应用。本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其有益效果包括以下方面：试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要使用几种简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用；结果判定直观，眼观即可；操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
【专利说明】一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及检测试剂盒，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003]鸭疫里默氏杆菌iRiemerella anatipestifer, RA)是鸭疫里氏杆菌病的病原，可引起家鸭、鹅、火鸡及多种家禽和野禽发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性浆膜炎(duckinfectious serositis)。发病鸭比较明显的病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎等。类似的病理变化也见于火鸡和其它禽类。本病最早于1932年在美国纽约州的长岛发现，随后迅速蔓延至世界各地。我国在1982年首次证实本病存在，目前各养鸭省区均有发生，且发病率和死亡率很高，给养鸭业造成重大经济损失。
[0004]RA血清型众多，目前报道确认的有21个血清型，各血清型间缺乏有效的交叉免疫保护，给疫苗预防带来了很大难度。我们从山东、河南以及广东的鸭场中分离到87株RA，用玻板凝集试验和试管凝集试验对其血清型进行了鉴定。其中血清I型27株，血清2型25株，血清10型18株，其它血清型17株，说明目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型。
[0005]用试剂盒检测RA抗体是诊断RA感染进而开展RA流行病学调查的有效手段。琼脂扩散试验可检测RA血清抗体，但敏感性较低。另外，间接ELISA方法研究的较多，使用的抗原种类有灭活全菌体、超声波破碎菌体后的裂解物、脂多糖、表达的重组蛋白等。绝大多数报道仅仅初步建立了 ELISA方法，并没有进一步对所建立的方法进行优化，也没有开展临床试验，验证ELISA方法的实际应用效果。到目前为止，没有一种实现商品化的检测RA血清抗体的试剂盒，在国内外都是空白。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，鉴于目前我国流行的优势RA血清型为1、2和10型，提供了一种可简单快速的检测RA血清1、2和10型抗体的试剂盒，用来开展大范围的RA流行病学调查和免疫水平监测。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒,所述试剂盒中包括:
(O鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原；
(2)标准阳性血清；
(3)标准阴性血清；
(4)稀释液。
[0008]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述制备鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6。
[0009]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。
[0010]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤:
1)静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4°C静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为PH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液；
2)将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；
3)以步骤2)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤I)得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50 μ g/ml-100 μ g/ml ο
[0011]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，述标准阳性血清的制备方法为:取-75 °C冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于IOml含5%小牛血清的营养肉汤中，37°C,200r/min培养15-18小时，然后把IOml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37°C摇床中200r/min培养12-15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用IOml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用鸭疫里默氏杆菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫兔，得到分离血清，效价达25及以上即为标准阳性血清。
[0012]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阴性血清的制备方法为:收集体重2.5公斤的健康新西兰白兔的颈动脉血，室温过夜，再以离心转速3000r/min离心15min,取上清即得到标准阴性血清。
[0013]进一步的，上述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述稀释液的制备方法为:配制PH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4.12H20，30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。
[0014]本发明的第二个目的是提供了上述一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌血清I型、血清2型和血清10型抗体效价中的应用。
[0015]进一步的，上述的应用，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为:
a)在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1_12孔，第8排的1_8孔各加稀释液50μ I ；
b)在血凝板1-6排的第I孔各加I份待检血清,每份血清50μ 1，用排枪从血凝板1-6排的第I孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第I孔加50 μ I标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第I孔加50 μ I标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
c)每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μI ;
d)血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37°C静置1.5-2小时；
e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
[0016]本发明的有益效果为:本发明提供的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，其优越性包括以下方面:
a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发明中的试剂盒在检测样品时只需要110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃盖板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养鸭场也可以使用；
b.结果判定直观，眼观即可；
c.操作人员不需要专业知识，不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测；
d.成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为RA血清I型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
[0018]图2为RA血清2型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
[0019]图3为RA血清10型间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清以及大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清。
[0020]图1-3中，“ + ”表示检测标准阳性血清，“-”表示检测标准阴性血清，“空白”表示不加血清的空白对照，“大肠”表示检测大肠杆菌的阳性血清，“沙门”表示检测沙门氏菌的阳性血清，“巴氏”表示检测巴氏杆菌的阳性血清。RA血清I型、2型和10型间接血凝抗原分别检测同型标准阳性血清，检测到的血清抗体效价分别为211 (图1).21° (图2)和29 (图
3);检测阴性血清、空白对照均成立；检测大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的阳性血清均呈现阴性反应。
[0021]图4为琼脂扩散试验检测RA血清I型标准阳性血清。
[0022]图5为琼脂扩散试验检测RA血清2型标准阳性血清。
[0023]图6为琼脂扩散试验检测RA血清10型标准阳性血清。
[0024]图4-6中，RA血清I型、2型和10型抗原分别检测同型标准阳性血清,检测到的血清抗体效价分别为27 (图4)、25 (图5)和25 (图6)。
【具体实施方式】
[0025]实施例1: 本发明涉及的检测鸭疫里默氏杆菌(RA)血清1、2和10型抗体效价的间接血凝试剂盒中包括:
RA抗原I瓶(冻干)，-20°C冻存；
标准阳性血清I瓶(0.5ml)，-20°C冻存；
标准阴性血清I瓶(0.5ml)，-20°C冻存；
稀释液3瓶(10ml/瓶)，4°C保存。
[0026]试剂盒可检测40-50份血清，保存期为I年。
[0027]用来制备抗原的RA菌株为田间分离株，共3株:WF2(血清I型，2010年分离)，WF7(血清2型，2010年分离)，XY6 (血清10型，2010年分离)，保存于中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室。
[0028]本发明的试剂盒中各种试剂的制备方法是:
1.间接血凝抗原:
将WF2、WF7、XY6菌株增菌培养，超声破碎后，再离心取上清，作为抗原致敏鞣酸处理后的绵羊红细胞；
2.标准阳性血清:
将WF2、WF7、XY6菌株增菌培养，灭活后与佛氏佐剂混合，免疫健康新西兰白兔，获得高效价的血清抗体；
3.标准阴性血清:
采自健康新西兰白兔的血清；
4.稀释液:
PH7.2的磷酸盐缓冲液(0.1M/L)，含1%兔血清和0.01%叠氮钠。
[0029]本发明的试剂盒的使用方法是:
a.在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1-12孔，第8排的1-8孔各加稀释液50μ I ；
b.在血凝板1-6排的第I孔各加I份待检血清,每份血清50μ 1，用排枪从血凝板1-6排的第I孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔，在第7排的第I孔加50 μ I标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔，在第8排的第I孔加50 μ I标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照；
c.每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μI ;
d.血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37°C静置1.5-2小时；
e.根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
[0030]本发明的具体实施方法为:
一、RA间接血凝抗体检测试剂盒组成:
试剂盒中包括RA抗原I瓶(冻干)，-20°C冻存；标准阳性血清I瓶(0.5ml)，-20°C冻存；标准阴性血清I瓶(0.5ml), -20°C冻存；稀释液3瓶(IOml/瓶)，4°C保存，试剂盒可检测40-50份血清，保存期为I年，检测RA血清1、2和10型血清抗体的试剂盒分别组装。
[0031]二、RA间接血凝抗体检测试剂盒的制备:
1.标准阳性血清的制备: 首先取出_75°C冻存的RA甘油菌WF2 (血清I型)、WF7 (血清2型)和XY6 (血清10型)，用接种环蘸取少量菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于IOml含5%小牛血清的营养肉汤中，37°C，200r/min培养15-18小时，然后把IOml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37°C摇床中200r/min培养12-15小时；培养完毕后，将全部菌液6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用IOml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，作为超声破碎用菌体；
将上述制备的RA菌液置于碎冰中，再放到超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清；测定上述制备的上清中的蛋白浓度:经紫外分光光度计检测，WF2、WF7和XY6菌液上清中的蛋白浓度分别为10.49mg/ml、12.43 mg/ml和11.28 mg/ml，这些上清液作为制备RA阳性血清用抗原，以及后续致敏绵羊红细胞的抗原，冻存于_75°C备用；
将上述制备的WF2抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康新西兰白兔，接种抗原量200 μ g/只，2周后用同等剂量的抗原(与等体积弗氏不完全佐剂混合)加强免疫I次，间隔2周后再加强免疫I次，第3次免疫后2周，兔耳静脉采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达25及以上为合格阳性血清，若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准；
同时制备WF7血清2型、XY6血清10型标准阳性血清，所用的方法与制备WF2血清I型标准阳性血清的方法相同；
经琼脂扩散试验检测，所制备的RA菌株1、2和10型标准阳性血清的抗体效价均达到25及以上，符合标准。
[0032]2.标准阴性血清的制备:
选取体重2.5公斤左右的健康新西兰白兔，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，取上清即为标准阴性血清；
3.稀释液的制备:
配制PH7.2的磷酸盐缓冲液，即称取206.21克Na2HPO4.12H20，30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。
[0033]4.RA间接血凝抗原制备:
静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4°C静置3-5天后，按常规方法对细胞进行洗涤、戊二醛固定、1/40000的鞣酸处理，此过程中所用的溶液均为PH7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度；
致敏用抗原与制备标准阳性血清中所用的抗原相同，即为WF2、WF7和XY6菌液的超声裂解上清，蛋白浓度分别为10.49mg/ml、12.43 mg/ml和11.28 mg/ml,抗原制备方法与步骤I “标准阳性血清的制备”相同；
首先确定致敏绵羊红细胞的最佳抗原量，取制备好的10%浓度的红细胞5份，每份5ml，取制备好的WF2菌株(血清I型)抗原，以终浓度25 μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml, 150 μ g/ml, 200 μ g/ml分别致敏红细胞，致敏时放于37°C水浴中，致敏时间为30min，期间每隔5min混匀一次，以防细胞沉淀，致敏后用PH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤4遍，再用稀释液洗涤I遍，最后用稀释液将红细胞悬浮至50ml，细胞终浓度为1%。共得到5种不同终浓度的蛋白致敏的间接血凝抗原，分别标记为AG1、AG2、AG3、AG4和AG5。
[0034]检测抗原质量:取2块110°血凝板，在第I块板的第1-5排的1_12孔、第2块板的第1-5排的1-8孔，分别加入稀释液，50 μ I/孔，然后在第I块板的第1-5排的第I孔，分别加入50 μ I标准阳性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第12孔，在第2块板的第1-5排的第I孔，分别加入50 μ I标准阴性血清，用排枪依次往后作2倍倍比稀释，直至第4孔，第5-8孔为空白对照，最后加入充分摇匀的间接血凝抗原，25 μ I/孔。2块板的第I排均加入AG1，第2排加入AG2，第3排加入AG3，第4排加入AG4，第5排加入AG5。然后将血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37°C静置1.5-2小时；
结果判定:以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
[0035]与制备WF2间接血凝抗原相同的方法，制备WF7、XY6间接血凝抗原，并检测抗原质量。
[0036]5种不同浓度的抗原致敏红细胞，得到的间接血凝抗原检测标准阳性、阴性血清的结果如表1所示。
[0037]
【权利要求】
1.一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括: (1)鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原； (2)标准阳性血清； (3)标准阴性血清； (4)稀释液。
2.根据权利要求1所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述制备鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的鸭疫里默氏杆菌菌株为田间分离株，分别为血清I型WF2、血清2 型WF7和血清10型XY6。
3.根据权利要求2所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原是将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。
4.根据权利要求3所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤: 1)静脉采集绵羊红细胞，保存于灭菌阿氏液中，在4°C静置3-5天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和1/40000的鞣酸处理，所用的溶液均为PH 7.2的磷酸盐缓冲液，制备好的绵羊红细胞用PH7.2的磷酸盐缓冲液悬浮至10%浓度，得到绵羊红细胞悬液； 2)将鸭疫里默氏杆菌菌株WF2、WF7和XY6的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原； 3)以步骤2)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤I)得到的绵羊红细胞悬液，得到鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗原，三种抗原致敏红细胞的终浓度为50 μ g/ml-100 μ g/ml ο
5.根据权利要求4所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为:取_75°C冻存的鸭疫里默氏杆菌甘油菌血清I型WF2、血清2型WF7和血清10型XY6，用接种环蘸取菌液，划线接种于含5%绵羊血的营养肉汤琼脂平板上，置于37°C、5% CO2箱中培养15-20小时，再挑取单克隆菌株接种于IOml含5%小牛血清的营养肉汤中，370C，200r/min培养15-18小时，然后把IOml菌液转接到200ml含5%小牛血清的营养肉汤中，继续在37°C摇床中200r/min培养12-15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用PH7.2磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用IOml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用鸭疫里默氏杆菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，按常规破碎程序超声破碎20min，然后冻融I次，再超声破碎I次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清与弗氏完全佐剂等体积混匀，免疫兔，得到分离血清，效价达25及以上即为标准阳性血清。
6.根据权利要求5所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阴性血清的制备方法为:收集体重2.5公斤的健康新西兰白兔的颈动脉血，室温过夜，再以离心转速3000r/min离心15min，取上清即得到标准阴性血清。
7.根据权利要求6所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液的制备方法为:配制PH7.2的磷酸盐缓冲液(0.1M/L)，即称取206.21克Na2HPO4.12H20,30.46克KH2PO4,68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，高压灭菌，冷却后加入体积百分比为1%的兔血清和质量体积百分比为0.01%的叠氮钠，即为稀释液。
8.如权利要求1-7任一所述的一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测鸭疫里默氏杆菌血清I型、血清2型和血清10型抗体效价中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为: a)在110°血凝板1-6排的1-8孔，第7排的1_12孔，第8排的1_8孔各加稀释液50μ I ； b)在血凝板1-6排的第I孔各加1份待检血清,每份血清50μ 1，用排枪从血凝板1-6排的第I孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔；在第7排的第I孔加50 μ I标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔；在第8排的第I孔加50 μ I标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5-8孔为空白对照； c)每孔加入充分摇匀的间接血凝抗原25μI ; d)血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37°C静置1.5-2小时； e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗 体效价。
【文档编号】G01N33/531GK104007269SQ201410214701
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】刘永生, 郑福英, 宫晓炜, 陈启伟 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所