一种人ca125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的制作方法

一种人ca125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，包括如下组分：各不同固定浓度的CA125蛋白标准品；阳性质控品；阴性质控品；pH7.2的0.01M的磷酸缓冲液；多克隆抗体稀释液；包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板；能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液；25×洗板液。本发明的试剂盒中作为检测抗体的多克隆抗体用CdTe量子点进行标记，由于采用的量子点标记法具有激发光谱宽，自发荧光弱，荧光稳定和半衰期长等特点，因此检测时可大大提高了检测的分辨率、灵敏度和特异性。
【专利说明】—种人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂
合
Si
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫诊断【技术领域】，特别涉及人CA125蛋白的定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]CA125是一种相对分子质量为200kD的糖蛋白，普遍分布于胸膜、心包、腹膜、子宫内膜、生殖道和羊膜等间皮组织细胞表面。当这些部位发生恶性变或受到炎症刺激时，血清中CA125的水平将显著升高。CA125作为卵巢癌的主要标志用于卵巢癌疗效和复查监测。大多数卵巢癌患者的CA125浓度会呈现一种持续性升高趋势，可以作为患者疾病进展、预后和检验化疗疗效的标志物。在消化道恶性肿瘤(如胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌)以及一些良性肝脏病、肺腺癌、盆腔炎性病变、子宫内膜异位症时，血清CA125水平亦可升高。在卵巢良性囊腺瘤和恶性囊性上皮瘤的穿刺液中，CA125水平可明显升高。因此CA125不能作为卵巢癌单一的检测指标。对早期卵巢癌，该检测常与其他检查如经阴道超声和经直肠阴道的盆腔检查一起进行来提高诊断的准确性。另外，与其他肿瘤标志物共同检测或进行连续检测也可以降低诊断的假阳性结果。该检测对预测卵巢癌患者的治疗效果也很有价值，化疗期间若CA125降低则表明化疗有效，若治疗后持续阳性则往往预示肿瘤的复发。目前临床上用于测定CEA的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
[0003]过去以放免为代表的糖类抗原125(CA125)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。其中，酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性结果；而量子点(QDs)具有连续而宽的激发光光谱，其荧光可被波长小于其量子限域峰的任意光源所激发，且荧光谱峰位置可以通过改变量子点物理尺寸进行调控。这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种不同颜色荧光的量子点进行多元荧光检测。有效提高了分辨率和灵敏度。因此，量子点免疫分析法远远优于酶免疫测定。
[0004]目前还未有采用量子点免疫分析检测人血清中CA125含量的方法，也未有与其相关的试剂盒。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是开发一种采用量子点免疫分析的方法检测人血清中CA125含量的试剂盒，其检测速度快且灵敏度高。
[0006]本发明提供了一种人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，包括如下组分:
[0007]各固定浓度分别为OU/ml、10U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml 的 CA125蛋白标准品；
[0008]阳性质控品；
[0009]阴性质控品；[0010]pH7.2的0.0lM的磷酸缓冲液；
[0011]多克隆抗体稀释液；
[0012]包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板；
[0013]能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液；
[0014]25 X 洗板液。
[0015]其中所述各固定浓度的CA125蛋白标准品的制备方法优选为:大量培养人卵巢癌细胞Ovcar-3，取细胞培养液，透析浓缩后使用分子筛分离出纯化的CA125蛋白，再使用pH7.2、浓度为 0.0lM 的 PBS 缓冲液稀释成 OU/ml、I OU/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、IOOOU/ml o
[0016]所述纯化的CA125蛋白的制备方法优选如下:
[0017]步骤一:使用含10% FBS,3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3的DMEM完全培养液培养人卵巢癌细胞0vcar-3，37°C，5% CO2培养72小时；
[0018]步骤二:收集细胞培养液，使用细胞培养液体积20倍的pH7.2、浓度为0.0lM的PBS缓冲液用截留分子量为5kD的透析袋透析，透析后再用含有30%的PEG-6000且pH7.2、浓度为0.0lM的PBS缓冲液20倍浓缩；
[0019]步骤三:将步骤二浓缩后的细胞培养液以2ml/min的速度流过截留分子量为50-400kD的分子筛，使用快速蛋白纯化仪收集200kD左右的峰的蛋白，即为CA125蛋白。
[0020]步骤四:将收集的CA125蛋白20倍浓缩，方法同步骤二，得到纯化后的CA125抗原。
[0021]所述阴性质控品为样品稀释液，所述样品稀释液为含I BSA、0.05的Tween-20且pH7.2、浓度为0.0lM的磷酸盐缓冲液；所述阳性质控品为将纯化后的CA125抗原用样品稀释液稀释成浓度为800U/ml的溶液；所述25X洗板液为含0.5% Tween-20且pH7.2、浓度为0.0IM的PBS缓冲液。
[0022]所述多克隆抗体稀释液优选为含0.5%牛血清白蛋白、0.1%吐温-20且pH7.2、浓度为0.0lM的磷酸盐缓冲液。
[0023]所述包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板的制备方法优选如下:
[0024]将鼠抗人CA125单克隆抗体用pH7.2、浓度为0.0lM的磷酸盐缓冲液调整浓度为2μ g/ml,酶标板每孔加100 μ I, 4°C孵育过夜,弃去包被液,然后加300 μ I/孔含0.1%Tween-20的PBST溶液洗涤三次，拍干；每孔再加入200 μ I含0.1 % Tween_20、5 %牛血清白蛋白且pH7.2、浓度为0.0lM的磷酸盐缓冲液,即封闭液，4°C封闭过夜,弃去封闭液,然后加300 μ I/孔含0.1 % Tween-20的PBST溶液洗涤三次，拍干。
[0025]所述鼠抗人CA125单克隆抗体的制备方法优选如下:
[0026]I)选用8?10周BALB/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前I?2周，先给小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂；
[0027]2)收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤I次，重悬于含3.5g/L Hepesl.9g/LNaHCO3的无血清的DMEM培养液中，调整细胞密度为I?2X 106/ml，得到细胞悬液；
[0028]3)每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液，接种细胞7?12天，小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠头部，使腹水滴入离心管中；间隔2~3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2~3次，将收集到的腹水经3000rpm离心15min，弃去上层油脂、细胞成分和其他沉淀物，吸取淡黄色腹水；采用饱和硫酸铵沉淀法粗纯化以及亲和层析柱法纯化杂交瘤细胞腹水，得到浓度为1.2mg/ml的纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体。
[0029]所述能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液的制备方法优选如下:取0.1mM的CdTeQDs600ul,加入18ul浓度为lmg/ml的二氣乙烧和800ul的甲醇混合后避光以800rpm震汤30min,再加入8ul的β _疏基乙醇进打终止即为活化后的QDs，取0.75mg的纯化后的鼠抗人CA125多克隆抗体血清用pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液稀释至4 μ g/ml,加入活化后的QDslOul中与之混合，避光800rpm震荡2小时，反应结束后再加入巯基乙醇20 μ I稳定量子点，然后用截留分子量为12kD的透析袋透析，透析后在16300Xg条件下离心3min，去除上清，得到沉淀，即为纯化的偶联有量子点的鼠抗人CA125多克隆抗体血清，将沉淀重悬于pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液。
[0030]所述CdTeQDs的制备方法优选如下:
[0031]将2.5X ΙΟΛιοΙ的CdCl2.2.5Η20溶于25ml的超纯水中，加入3X l(T4mol的谷胱甘肽 GSH、0.1 g 的二水 合柠檬酸三钠、0.5X l(T4mol 的 Na2TeO3 和 2.4Χ ΙΟΛιοΙ 的 NaBH4,用磁力搅拌器以200rpm的条件下搅拌30分钟，在搅拌过程中用0.01M的NaOH调节PH至
10.5，，搅拌完成后放入功率设为600 W的带回流的微波装置中，当溶液颜色变成淡绿色时开始回流，回流反应4h，随着回流时间的不同形成一系列不同粒径1-1Onm的以谷胱甘肽为稳定剂的量子点，将反应后的溶液冷却至室温后用两倍体积无水乙醇在4000rpm的条件下离心5min进行沉淀，去除上清中过量的Cd2+、Te032 一等杂质，同样条件重复3遍，待乙醇完全挥发后，将沉淀重悬于的PH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到0.1mM的CdTeQDs ；
[0032]所述纯化后的鼠抗人CA125多克隆抗体血清的制备方法优选如下:
[0033]I)动物免疫
[0034]将上述纯化后的CA125抗原10000U溶入Iml pH7.2、浓度为0.01M的磷酸缓冲溶液中得到抗原溶液，在Iml弗氏不完全佐剂中加入灭活的结核分枝杆菌制成弗氏完全佐剂，并加入上述Iml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化得到抗原乳化液，用3ml注射器抽取该抗原乳化液，对兔子进行注射抗原乳化液，并进行若干次加强免疫；
[0035]2)收集抗血清
[0036]在加强免疫注射后的7~10天收集血液，待确定产生抗体后大量收集血液，将血液置于37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C静置过夜，用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10，OOOg离心10分钟，收集上清液即为抗血清；
[0037]3)抗体纯化
[0038]在抗血清中加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，40C，15，OOOg离心5分钟，移出上清液再经0.45 μ m的过滤器过滤除去多余的脂，将过滤除去多余的脂的抗血清用PH7.4且浓度为0.1M的TBS缓冲溶液以1:5的体积比进行稀释，再用0.45 μ m的过滤器进行过滤，以0.5ml/min的速度将过滤后的抗血清-TBS缓冲溶液上到GElml Protein A Sepharose预装柱上，连续上柱2次并保留上样流出液，用pH7.4且浓度为0.1M的TBS缓冲溶液清洗柱子至Αλ28_〈0.008后再用ρΗ4.5、浓度为0.1M的甘氨酸-HCl以0.5ml/min的速度洗脱，洗脱液立即转至PH7.2且浓度为0.01M的PBS缓冲液中透析过夜，按上述方法收集洗脱液至Αλ28(Ιηω〈0.008，得到纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清。
[0039]本发明还提供了所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤:
[0040]步骤一:取包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板，室温放置30min ；
[0041]步骤二:以100 μ I/孔待测样品加入步骤一中酶标板的板条孔中，同时用阴性质控品100 μ I作阴性对照、用阳性质控品100 μ I作阳性对照、各固定浓度的CA125蛋白标准品100 μ I分别加入到步骤一中酶标板的板条孔中，37°C反应I小时后用25X洗板液经过25倍稀释后的溶液冲洗3次，每次3min，拍干；
[0042]步骤三:用多克隆抗体稀释液将能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液1:10000稀释，每孔加入100μL，37?反应I小时后用用25X洗板液经过25倍稀释后的溶液冲洗3次,拍干,然后加入100 μ L的ρΗ7.2的0.01M的磷酸缓冲液；
[0043]步骤四:将处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值，通过CA125蛋白标准品的荧光强度值及相应的浓度建立标准曲线，得到r值大于0.990的检测线，阴性质控品及阳性质控品数值均在线性范围内，计算样品含量。
[0044]本发明的试剂盒中作为检测抗体的多克隆抗体用CdTe量子点进行标记，由于采用的量子点标记法具有激发光谱宽，自发荧光弱，荧光稳定和半衰期长等特点，因此检测时可大大提高了检测的分辨率、灵敏度和特异性。 【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1为纯化后的CA125抗原的蛋白凝胶电泳图片。
[0046]图2为用全自动酶标仪测定纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清的0D450nm值，并以稀释度为横坐标，OD值为纵坐标绘制的标准曲线。
[0047]图3为用全自动酶标仪测定纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体血清的0D450nm值，并以稀释度为横坐标，OD值为纵坐标绘制的标准曲线。
[0048]图4为用荧光酶标仪检测处理好的酶标板的荧光强度值。以不同浓度的纯化后的CA125抗原为横坐标，以相应的荧光强值为纵坐标，绘制曲线。
【具体实施方式】
[0049]以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0050]实施例1.CA125蛋白的纯化鉴定
[0051]大量培养人卵巢癌细胞Ovcar-3，取细胞培养液，使用分子筛分离CA125蛋白，具体步骤如下:
[0052]步骤一:使用含10% FBS 的 DMEM 完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)培养人卵巢癌细胞Ovcar-3 (人卵巢癌细胞Ovcar-3购自美国ATCC) ,37°C,5% CO2培养72小时。
[0053]步骤二:收集细胞培养液，使用细胞培养液体积20倍的PBS缓冲液(pH7.2，浓度为0.01M)透析(透析袋截留分子量5kD)，透析后再用含有30% (v/v)的PEG-6000的PBS缓冲液(ρΗ7.2，浓度为0.01Μ)20倍浓缩。
[0054]步骤三:使用快速蛋白纯化仪收集目的蛋白(CA125)，将步骤二浓缩后的细胞培养液以2ml/min的速度流过分子筛(GE S印hadexTMG-20050-400kD)，使用快速蛋白纯化仪收集200kD左右的峰的蛋白，即为CA125蛋白。
[0055]步骤四:将收集的蛋白液体(即步骤3的CA125蛋白)20倍浓缩，方法同步骤二，得到纯化后的CA125抗原。
[0056]通过蛋白凝胶电泳检测纯化后的CA125抗原的纯度，结果如附图1所示，测定其浓度为20000U/ml，用于后续试验。
[0057]实施例2.兔抗人CA125多克隆抗体制备与鉴定
[0058]1.动物免疫
[0059]准备两只成年兔(日本大耳白，4-6个月，体重2Kg，雄性)，将10000U即0.5ml实施例I中得到的纯化后的CA125抗原(20000U/ml)溶入Iml磷酸缓冲溶液(pH7.2，浓度为0.01M)中得到抗原溶液。在Iml弗氏不完全佐剂(石蜡油:羊膜脂=2: I)中加入灭活的结核分枝杆菌(终浓度为5mg/mL)制成弗氏完全佐剂，并加入上述Iml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化得到抗原乳化液，用3ml注射器抽取该抗原乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位:两处在后背，两处在大腿处进行皮下注射，抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤，捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为I?2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500 μ I抗原乳化液，注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒，每2?3周在上述4个部位重复上述操作注射抗原乳化液，共进行5次加强免疫并在加强免疫注射后的7?10天按照以下步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
[0060]2.收集抗血清
[0061]收集血液的方法为:将家兔轻轻放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23?0.3cm的切口使血液能自由的流出，用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集，收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10?20秒确定血流停止后方可结束。将血液置于37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C静置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，40C，10，OOOg离心10分钟，收集上清液即为抗血清(可在_20°C保存数年)。
[0062]3.抗体纯化
[0063]在抗血清中加入固体叠氮化钠至浓度为0.05% (m/v)，4°C，15，000g离心5分钟，移出上清液再经过滤器(0.45μπι)过滤除去多余的脂。
[0064]将上述过滤除去多余的脂的抗血清用TBS缓冲溶液(ρΗ7.4，浓度为0.1Μ)以1:5的体积比进行稀释，再用过滤器(0.45 μ m)进行过滤。以0.5ml/min的速度将过滤后的抗血清-TBS缓冲溶液上到柱上(GElml Protein A Sepharose预装柱)，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液(pH7.4，0.1M)清洗柱子至Αλ 280ΠΙ1<0.008后再用甘氨酸-HCl (ρΗ4.5，浓度为0.1Μ)以0.5ml/min的速度洗脱，洗脱液立即转至PBS缓冲液(pH7.2,0.01M)中透析过夜，按上述方法收集洗脱液至Αλ28(Ιηω〈0.008，得到纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清，再利用分光光度计测定其浓度为2.8mg/ml，分装后在2?8°C保存。
[0065]4.兔抗人CA125多克隆抗体血清的鉴定
[0066]4.1间接ELISA初步检测兔抗人CA125多克隆抗体血清灵敏度
[0067]I)包被
[0068]用PBS缓冲液(ρΗ7.20.01Μ)将纯化后的CA125抗原(实施例1的浓度为20000U/ml)稀释至蛋白质浓度分别为 20000U/ml、10000U/ml、5000U/ml、2500U/ml、1500U/ml、1000U/ml、500U/ml、250U/ml、100U/ml、10U/ml，取稀释的蛋白样品100 μ I加入每个聚苯乙烯板的反应孔中。次日，弃去孔内溶液，用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液(pH7.2，0.01M)洗3次,每次2min。
[0069]2)加样
[0070]将步骤3纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清按1:500、1:1000、1:2000、1:5000,1:10000倍稀释，取不同稀释浓度的液体100μ I加于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育2小时，用含0.1 % Tween-20的PBS缓冲液(ρΗ7.2，浓度为0.01Μ)洗3次，每次2min。
[0071]3)加酶标抗体
[0072]于各反应孔中，加入1:80000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG(购自Abnova公司，111-035-003, 2ml 装)100μ 1，37°C孵育 I 小时，经含 0.1 % Tween-20 的 PBS 缓冲液(ρΗ7.2，浓度为0.01Μ)洗3次，每次2min，然后拍干。
[0073]4)加底物液显色
[0074]于各反应孔中加入TMB显色液(购自碧云天司，P0209，IOOml装)100 μ 1，显色IOmin0
[0075]5)终止反应
[0076]于各反应孔中加入2Μ H2S0450 μ I终止反应。
[0077]结果判定:在ELISA检测仪上，于450nm处测OD值。以蛋白稀释度为横坐标，以450nm0D值为纵坐标，绘出曲线图。
[0078]结果显示，纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清1:10000稀释存在良好的线性关系的检测区间为OU?1000U。
[0079]4.2兔抗人CA125多克隆抗体血清的western blotting鉴定
[0080]I)电泳
[0081]配制12% SDS-PAGE凝胶，将实施例1得到的纯化后的CA125抗原分别按500U、250U、150U、100U、50U、25U、10U的量进行点样，使用80V恒压电泳；
[0082]2)转膜
[0083]采用半干电转法将PAGE凝胶中的蛋白转到NC膜上；
[0084]3)封闭
[0085]将NC膜放入含有5 % BSA的PBS缓冲液(ρΗ7.2，浓度为0.01Μ)中，IOOrpm封闭Ih ；
[0086]4)孵育一抗
[0087]一抗加入按I:500,1:1000、1:2000、1:5000、1:10000倍稀释的步骤3纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清，37°C孵育lh，经含0.1 % Tween-20的PBS缓冲液(pH7.2，浓度为0.01M)洗三遍；
[0088]5)孵育二抗
[0089]二抗是1:10000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG (购自Abnova公司，111-035-003, 2ml 装)，37°C孵育 Ih,经含 0.1 % Tween-20 的 PBS 缓冲液(ρΗ7.2，浓度为
0.01Μ)洗三遍；
[0090]6)显色
[0091]加显色液(DAB6.0mg ；0.01M PBS10.0ml)，避光室温显色至出现深色条带，
[0092]7)终止
[0093]最后放入双蒸水中终止反应；
[0094]结果显示，1:2000倍稀释的纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清可以很好的识别10U纯化后的CA125抗原。
[0095]4.3纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清的效价测定
[0096]采用间接ELISA法，其具体步骤如下:
[0097]I)包板
[0098]利用pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液将实施例1中纯化后的CA125抗原稀释至最适浓度50U/100ul，在每个酶标板中加入IOOul，放入湿盒，4°C包被过夜；
[0099]2)封闭
[0100]次日弃去包被液，使用含0.1% (v/v) Tween-20的PBST (pH7.2,0.01M)洗涤酶标板每反应孔4次,300ul/次,每次5min,甩干,加入含0.1 % (v/v) Tween-20>5% (m/v)牛血清白蛋白的封闭液(PBS缓冲液pH7.2，0.01M) 300 μ I/孔封闭，放入湿盒，4°C过夜；
[0101]3)酶标一抗
[0102]弃去封闭液，同上洗涤，用pH7.2、浓度为0.01M的PBS倍比稀释(l:(2nX100)，n ^ O的整数)纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清(步骤3) 100 μ I/孔，同时设立空白，阳性和阴性对照，37°C湿盒温育1.5h ；
[0103]4)酶标二抗
[0104]弃去血清，同上洗涤，再在每孔中加入用PBS(pH7.20.01M)稀释成1:80000的HRP-山羊抗兔 IgG(购自 Abnova 公司，111-035-003，2ml 装)100 μ 1，37°C 温育 I 小时。
[0105]5)加底物液显色
[0106]弃去酶标二抗，同上洗涤，TMB显色(同步骤4.1)，37°C避光显色lOmin。
[0107]6)终止反应
[0108]每孔加入50 μ I的2Μ H2SO4终止液终止反应。
[0109]结果测定:用全自动酶标仪测定0D450nm值,结果见附图2,横坐标为稀释度的log值，纵坐标为OD值。
[0110]结果显示，纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清的效价为1:25600。
[0111]实施例3.鼠抗人CA125单克隆抗体制备与鉴定
[0112]1.鼠抗人CA125单克隆抗体的制备
[0113]1.1动物免疫
[0114]a.将实施例1中纯化后的CA125抗原(20000U/ml)与等体积的弗氏完全佐剂(同实施例2)混合，剧烈震荡使之充分乳化，制成油包水CA125抗原乳剂，经SPF级纯系BALB/c、6?8周龄的雌性小鼠的背部皮下多点注射，每点100 μ I。每只小鼠免疫剂量为CA125抗原乳剂IOOOU0
[0115]b.两周后用实施例1中纯化后的CA125抗原(20000U/ml)与等体积的弗氏不完全佐剂混合(同实施例2)，充分乳化，经步骤a的SPF级纯系BALB/c、6?8周龄的雌性小鼠的背部皮下多点注射，每点100 μ I。每只小鼠免疫剂量为CA125抗原乳剂1000U。
[0116]c.分别于首次加强免疫(即步骤b)后的第2、4、6周进行加强免疫，其每次加强免疫操作方法、注射抗原乳剂和注射剂量均同步骤b。
[0117]用间接ELISA法(同实施例2步骤4.3)检测每次加强免疫后三天的血清抗体的效价，当检测到的血清抗体效价达到1:25600时仍可识别CA125抗原时即可，说明小鼠体内已产生抗CA125蛋白的抗体。
[0118]细胞融合前3天小鼠(因为实际上是在第四次加强免疫后效价达到1:25600仍可识别CA125抗原，因此此时间是在第四次加强免疫后，但也不排除第二、三次加强免疫的时间)尾静脉注射或腹腔注射100U(使用步骤b的抗原乳剂)再次加强免疫，为步骤1.3细胞融合用。
[0119]1.2SP2/0细胞的复苏与培养
[0120]从液氮罐中取出含有SP2/0细胞冻存管(取自武汉大学细胞库)，立即投入37°C水浴锅中，融化后于IOOOrpm离心5?lOmin，弃上清；配制含10%小牛血清的DMEM培养液(3.5g/L Hepes, 1.9g/L NaHCO3)培养复苏细胞。将细胞(I X IO6个)接种于正常BALB/c、6?8周龄的雌性小鼠背部两侧皮下。待瘤生长至3?5cm左右，即进行无菌摘瘤，用无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)洗涤3次后，用小剪刀剪成直径约2mm左右小块，加入预先加了 2?3ml无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)的200目铜筛中，用注射器芯研磨、挤压出单个肿瘤细胞，置含10% FBS的DMEM完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)中常规培养，使细胞维持对数生长期。融合前I天为SP2/0细胞换一次培养液，细胞计数器计数后，用含10% FBS的DMEM完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/LNaHCO3)调节细胞密度为I?5X IO5个/ml，融合当天取约I?5X107fSP2/0细胞收集至I个50ml无菌离心管中，离心弃上清,加入5ml无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)，混匀，得到SP2/0细胞溶液，细胞计数为I X IO7个/ml，备用。
[0121]1.3分离融合用小鼠脾细胞
[0122]取1.1中加强免疫的小鼠(细胞融合前3天尾静脉注射或腹腔注射过IOOU步骤b的抗原乳剂)，摘眼球采血处死，75%的酒精浸泡5?10分钟，固定于蜡盘；用75%的酒精消毒皮肤后，剪开腹部皮肤，暴露腹膜并用75%酒精擦拭消毒；用玻璃注射器吸取无血清DMEM培养液5ml注入小鼠腹腔，用注射器在腹腔内反复抽吸(注意不可刺破小鼠的消化器官)；用该注射器抽出腹腔内液体，注入50ml离心管内；换镊子，提起腹膜，换剪刀，暴露腹腔，无菌摘取脾脏，小心快速剪去周边脂肪和筋膜，用无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)洗I?2次，再将脾放入盛200目铜筛的平皿中，剪破包膜，用注射器芯研磨、挤压脾细胞过网，吸取无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3) 5ml吹打铜筛，收集过网后的脾细胞放入50ml无菌离心管中；将无菌离心管以IOOOrpm的速率离心5min ;弃上清，加入5ml无血清DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/LNaHC03)重悬细胞成为脾细胞溶液，细胞计数为I X IO5个/ml，待用；用含10% FBS的DMEM培养液(3.5g/LHepesl.9g/L NaHCO3)重悬沉淀的腹腔内巨噬细胞，得到巨噬细胞溶液(2X IO4个/ml)，加Λ 96孔培养板，10(^1/孔，然后置于371:、5% CO2培养箱内培养，备用。
[0123]1.4细胞融合和杂交瘤细胞的选择性培养
[0124]将上述1.2的SP2/0细胞溶液与1.3的脾细胞溶液按1:5的体积比混合共20ml，放入50ml无菌离心管中，以1000rpm的速率离心5min ;弃上清，轻弹管底，使沉淀松动，沿离心管壁缓慢滴加37°C预温的含PEG45% (v/v)的PBS溶液(pH7.2,0.01Μ) lml,同时缓慢转动离心管以混匀细胞，Imin内将PBS溶液加完；置37°〇水浴中Imin后，再于5min内缓慢加入37°C预温的无血清DMEM培养液(含3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3) 8ml,同时轻轻搅动使细胞成均一的悬液；置37°〇水浴中5min后，以1000rpm的速率离心5min，弃上清；加入37°C预温的HAT培养液[以含10% FBS的DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)为基础，添加2% (v/v) HAT溶液(购自Sigam公司)配成]，轻悬细胞，细胞计数总数为2 X IO6个/ml ο按IXlO5个脾细胞/孔滴加到含饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37°C、5% CO2培养箱中培养。融合后5~10天可根据克隆生长情况即使用HAT培养液(同上)半量换液；融合培养2周后可换HT培养液[以10% FBS的DMEM完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)为基础，添加I % (v/v) HAT溶液(购自Sigam公司)配成]，换液培养3周后可换含10% FBS的DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3);继续培养3~5天即可见小克隆出现，杂交细胞较大，呈圆形且透明，其他细胞透光性差并逐渐死亡；再培养8~12天，克隆生长至孔底面积的1/3~1/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测；一旦检测到分泌预定抗体的克隆细胞，应及时将阳性克隆转种到24孔培养板，再进一步转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养。
[0125]1.5分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选
[0126]细胞融合后，一旦长出大小适宜的克隆时，应及时选择灵敏、快速、可靠的免疫学方法筛选分泌预定抗体的杂交细胞克隆。本实验采用重组人ES抗原的间接ELISA法检测，其中一抗为杂交瘤细胞培养上清液，二抗为HRP-山羊抗鼠IgG (稀释度为1:80，000)。具体操作步骤同实施例2中4.3鼠血清效价检测。当检测到的培养上清抗体达到1:25600时仍可识别纯化后的CA125抗原，取其中效价最高的单孔单克隆细胞株标记为Al。
[0127]1.6亚克隆化培养
[0128]克隆化培养对于获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞株至关重要。一般需要进行3~4亚克隆化培养，以保证分泌性克隆生长的稳定性。采用有限稀释法，具体步骤如下:在含10% FBS 的 DMEM 完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)中加入 Al 孔(步骤 1.5)中的杂交瘤细胞，制成细胞密度为4X IO2个/μ I的细胞悬液，接种96孔培养板，每孔50 μ 1，37°C>5% CO2培养箱中培养过夜；次日用微量移液器吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于含10% FBS的DMEM完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)中；取样，用血球计数板计数，分别使用含10% FBS的DMEM完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)调整细胞密度至20个/ml、5个/ml ;分别将二种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养层细胞的培养板中，每孔50μ 1，使每孔分别含2、1、0.5个细胞；置于37°C、5% CO2培养箱中培养，一周后加补加 100 μ I 含 10% FBS 的 DMEM 完全培养液(3.5g/L Hepesl.9g/LNaHC03)，培养 12 ~15天，对有克隆的培养上清进行抗体检测(方法同实施例2中4.3);对阳性单克隆细胞再克隆化培养(培养条件同上)，直到100%的克隆分泌特异性抗体为止；同时将阳性克隆进一步扩大培养、冻存。
[0129]1.7鼠抗人CA125单克隆抗体的大量制备及纯化
[0130]在细胞培养过程中杂交瘤能产生和分泌单克隆抗体，约10?100μ g/ml。为了获得大量高效价抗体，通常将杂交瘤细胞植入BALB/c小鼠体内，制备并收集含特异性单克隆抗体的腹水，方法如下:
[0131]I)选用8?10周BALB/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前I?2周，先给小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂(配方同实施例2)；
[0132]2)收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤I次，重悬于无血清的DMEM培养液(3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3)中，调整细胞密度为I?2X 106/ml，得到细胞悬液；
[0133]3)每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液；密切观察小鼠的健康状况与腹水征象，接种细胞7?12天，可见小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠头部，使腹水滴入离心管中；间隔2?3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2?3次(每次抽取Iml)。将收集到的腹水经3000rpm离心15min，弃去上层油脂、细胞成分和其他沉淀物，吸取淡黄色腹水；采用饱和硫酸铵沉淀法粗纯化以及亲和层析柱法(GElml Protein A Sepharose预装柱)纯化杂交瘤细胞腹水，得到纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体，其浓度为1.2mg/ml。
[0134]2.纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体的鉴定
[0135]2.1间接ELISA初步检测纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体灵敏度
[0136]将实施例1 的纯化后的 CA125 抗原分别按 2000U、1000U、500U、250U、150U、100U、50U、25U、10U、1U的量进行包被(方法同实施例2中4.1步骤)，一抗加入按1:500、1:1000、
1:2000,1:4000倍稀释的纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体(步骤1.7中所得)，二抗是1:80000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG (购自Abnova公司，111-035-003，2ml装)，37 °C孵育 lh，经含 0.1% Tween-20 的 PBS 缓冲液(ρΗ7.2，浓度为 0.01Μ0.1% Tween-20)洗三遍后拍干，加入TMB显色液(购自碧云天公司)100μ 1，显色lOmin，加入2M H2S0450 μ I终止反应，450nm测OD值。具体方法同实施例2中步骤4.1。以蛋白稀释度为横坐标，以450nm0D值为纵坐标，绘出曲线图。
[0137]结果显示，纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体稀释度为1:4000时存在良好的线性关系的检测区间OU?1000U。
[0138]2.2鼠抗人CA125单克隆抗体的western blotting鉴定
[0139]将实施例1 纯化后的 CA125 抗原分别按 500U、250U、150U、100U、50U、25U、10U 的量进行SDS-PAGE胶点样，一抗加入按1:500、1:1000倍稀释的纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体(步骤1.7中收集所得)，二抗是1:10000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG (购自Abnova公司，111-035-003，2ml装)，具体方法同实施例2中步骤4.2。
[0140]结果，稀释度为1:1000的纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体可以很好的识别10U纯化后的CA125抗原。
[0141]2.3纯化后抗CA125单克隆抗体的效价测定
[0142]采用间接ELISA法，用实施例1的纯化后的CA125抗原50U/100 μ I包被，4°C过夜；洗涤后5%脱脂奶粉封闭过夜；将纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体(实施例3步骤1.7)系列稀释作为一抗，37°C温育2h ;洗涤后HRP-标记的山羊抗小鼠IgGl: 80，OOO稀释作为二抗，37°C温育Ih ;洗涤后加底物显色并及时终止，测0D450值，其它具体条件同实施例2的
4.3。
[0143]结果见附图3，纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体的效价为1:512。
[0144]2.4鼠抗人CA125单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚型鉴定
[0145]参照Sigma公司抗体亚型检测试剂盒说明书,采用Antigen-Mediated ELISA法测定单克隆抗体的Ig类别和亚型，测定的所得纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体(实施例3步骤1.7)均为α亚型。
[0146]实施例4制备CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液
[0147]4.1CdTe量子点的合成
[0148]将CdCl2.2.5H20(2.5Xl(T4mol)溶于25ml的超纯水中，加入谷胱甘肽 GSH(3Xl(T4mol)、二水合柠檬酸三钠(0.1 g )、Na2TeO3 (0.5 X ΙΟΛιοΙ)和NaBH4(2.4X10_4mOl)，用磁力搅拌器以200rpm的条件下搅拌30分钟，在搅拌过程中用NaOH (0.01M)调节PH至10.5，所有反应都是在室温环境下，搅拌完成后放入带回流的微波装置中(功率设为600 W )，当溶液颜色变成淡绿色时开始回流，回流反应4h，随着回流时间的不同形成一系列不同粒径(1-1Onm)的以谷胱甘肽为稳定剂的量子点。将反应后的溶液冷却至室温后用两倍体积无水乙醇在4000rpm的条件下离心5min进行沉淀。去除上清中过量的Cd2+、TeO32 一等杂质，同样条件重复3遍，待乙醇完全挥发后，将沉淀重悬于的PBS缓冲液(pH7.4,0.01Μ)中，得至IJ CdTeQDs (CdTe量子点)，即为活化后的CdTeQDs (0.1mM)。
[0149]4.2CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联及纯化(作为标记二抗)
[0150]取上述浓度的CdTeQDs600ul，加入18ul的EDC(二氯乙烷)(lmg/ml)和800ul的甲醇混合后避光震荡30min (SOOrpm)，再加入Sul的β -巯基乙醇进行终止即为活化后的QDs，取0.75mg的纯化后的鼠抗人CA125多克隆抗体血清(实施例2)用PBS (pH7.2，浓度为
0.01M)稀释至Aug/ml，加入活化后的QDslOul中与之混合，避光震荡2小时(800rpm)，反应结束后再加入巯基乙醇20 μ I稳定量子点，然后透析(透析袋截留分子量12kD)。透析后在16300Xg条件下离心3min，去除上清，得到沉淀，即为纯化的偶联有量子点的鼠抗人CA125多克隆抗体，将沉淀重悬于PBS (pH7.20.01M)中，得到CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液，浓度为5mg/ml，4°C保存。
[0151]经过间接ELISA法(方法同实施例2步骤4.3)，一抗为鼠抗人CA125单克隆抗体，标记二抗为CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液,检测发现标记二抗在1:5000的稀释条件下检测效果最好。
[0152]实施例5
[0153]本实施例提供了人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒及其检测方法。
[0154]所述人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒,包括:
[0155]包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板；
[0156]各固定浓度(0U/ml、10U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml)
[0157]的CA125蛋白标准品；
[0158]阳性质控品；[0159]阴性质控品(样品稀释液)；
[0160]ρΗ7.2 的 0.0lM 的磷酸缓冲液(PBS)；
[0161]多克隆抗体稀释液；
[0162]能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液；
[0163]25 X 洗板液。
[0164]其中:
[0165]I)各种试剂溶液的配制:
[0166]Α.各固定浓度的CA125蛋白标准品为纯化的CA125抗原(实施例1，20000U/ml)使用 PBS 缓冲液(pH7.2,0.01Μ)稀释成 OU/ml、10U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml ；
[0167]B.阳性质控品为将纯化后的CA125抗原(实施例1，20000U/ml)用下面的样品稀释液稀释成浓度为800U/ml的溶液；
[0168]C.阴性质控品为未含有CA125抗原的样品稀释液；样品稀释液为含I % BSA、
0.05%的 Tween-20 的磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.01Μ)；
[0169]制备方法:称取Ig牛血清白蛋白(BSA)溶于IOOml磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.01Μ)，再加入 0.05ml Tween-20,混勻。
[0170]D.ρΗ7.2 的 0.0lM 的磷酸缓冲液(PBS)；
[0171]制备方法:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20) 2.9g，氯化钠(NaCl) 8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，溶于9500ml水，用IM HCL调节pH值至7.2，用双蒸水定容至 1000ml。
[0172]制备方法:称取5g牛血清白蛋白溶于IOOml磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.01M)；
[0173]E.多克隆抗体稀释液为含0.5%牛血清白蛋白、0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液(ρΗ7.2，0.01Μ)；
[0174]制备方法:称取0.5g牛血清白蛋白溶于IOOml磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01M)，再加入 0.1ml Tween-20,混勻。
[0175]F.包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板。
[0176]将鼠抗人CA125单克隆抗体(实施例3步骤1.7)用磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.01M)调整浓度为2 μ g/ml,酶标板每孔加100 μ I抗体稀释液，4°C孵育过夜,弃去包被液,然后加 300 μ I/ 孔 PBST 溶液[PBS(pH7.2,0.01Μ), 0.1 % (v/v)吐温-20]洗涤三次，拍干；每孔再加入200μ I含0.1% (v/v) Tween-20,5 % (m/v)牛血清白蛋白的封闭液(PBS缓冲液pH7.2，0.01M)，4°C封闭过夜，弃去封闭液，然后加300 μ I/孔含0.1 % (v/v)Tween-20的PBST (pH7.2,0.01M)洗涤三次，拍干。
[0177]G.能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液(来自实施例4的4.2)。
[0178]H.25X 洗板液为含 0.5% Tween-20 的 PBS 缓冲液(PH7.2，0.01M)；
[0179]制备方法:称取磷酸二氢钾(KH2PO4) 5g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20) 72.5g，氯化钠(NaCl) 200g，氯化钾(KCl) 5g，溶于950ml水，用IM HCL调节PH值至7.2，再加入125mlTween-20,最后用双蒸水定容至1000ml。[0180]2)样品处理:将被检血清用样品稀释液做适当比例(如1:4)的稀释。
[0181]3)人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的检测方法步骤如下:
[0182]A.取包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板，室温放置30min。
[0183]B.加样:以100μ I/孔待测样品(步骤2)中)加入步骤A中酶标板的板条孔中，同时设阴性对照(阴性质控品)100 μ 1、阳性对照(阳性质控品)100 μ 1、各固定浓度的CA125蛋白标准品100μ 1，37°C反应I小时后用IX洗板液(将25 X洗板液用三蒸水稀释成I X)冲洗3次，每次3min，拍干。
[0184]C.加偶联体溶液:用多克隆抗体稀释液将能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液1:10000稀释，每孔加入100yL，37°C反应I小时后用IX洗板液(将25X洗板液用三蒸水稀释成IX)冲洗3次，拍干，然后加入100 μ L的ρΗ7.2的0.01M的磷酸缓冲液(PBS)。
[0185]D.检测:将处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值。通过CA125蛋白标准品的荧光强度值及相应的浓度建立标准曲线，得到检测线(r值大于0.990)，线性关系很好，可用于样品含量计算；阴性质控品及阳性质控品数值均在线性范围内，说明该系统可用于样品检测。
[0186]4)试剂盒性能指标考核
[0187](I)试剂盒的检测区间
[0188]I)取包被好鼠抗 人CA125单克隆抗体并且封闭的酶标板(上述实施例5中F酶标板)，室温放置半小时。
[0189]2)加入CA125蛋白标准品(实施例1的纯化后的CA125抗原)做适当比例的稀释后的稀释液(实施例5中的各固定浓度的标准品)，每个样品做3个重复孔，IOOul/孔，37°C反应I小时后用洗板液洗板3次，将酶标板拍干。
[0190]3)用PBS(pH7.2，0.01M)稀释兔抗人CA125多克隆抗体血清(实施例2) 1:10000稀释后，每孔加IOOul, 37 °C反应I小时后用25X洗板液洗板3次，拍干后加入IOOulPBS (pH7.2,0.01M) ?
[0191]将步骤3)处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值。以不同浓度的CA125的蛋白标准品为横坐标，以相应的荧光强值为纵坐标，绘制曲线。
[0192]结果，如附图4所示，本试剂盒具有良好的线性关系的检测区间为0U-1000U，如果被检测血清超过1000U，建议用样品稀释液稀释后再进行检测。
[0193](2)试剂盒灵敏度(最低检测量)
[0194]以零参考标准品(A点)(即样品稀释液)当作标本，经过间接ELISA法，即方法同(实施例5中3)人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的检测方法)，使用荧光酶标仪488nm波长测量20次，计算其荧光值均值及标准差。以A点测定值的均值加上2倍的标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。
[0195]结果显示,最低检测量为〈3U。
[0196](3)试剂盒的稳定性
[0197]将自制试剂盒的三批试剂分别放置于4°C半年及一年，37°C放置7天后，分别经过间接ELISA法(实施例5中3)人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的检测方法)，使用488nm波长测量荧光强度值，比较与放置前参考标准品各点荧光强度值间的线性关系及零标准品荧光强度值，测试稳定性。结果显示，该试剂盒有良好的稳定性。
[0198]实施例6抗人CA125Elisa检测试剂盒的评价
[0199]为检测双抗夹心酶联免疫(DAS-ELISA)检测试剂盒的效果，本实施例用实施例5的试剂盒对594份正常人血清样本(正常人血清样本的标准:血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期)中的人CA125蛋白含量进行了测定。其中男性348人(年龄18?78岁)，女性246人(年龄21?75岁)，检测最低值为OU/ml，最高值为39.40U/ml，平均浓度(X)为9.63U/ml，标准差(SD)为
6.26U/ml。其中，大多数标本(88.94% )的浓度值在10U/ml以下，浓度在10.0?36.0U/ml的标本有57份，当浓度值在36U/ml以下时，包含了 98.38%的标本。综合现有研究及临床现行参考值，将本试剂盒检测时的CA125血清正常参考值范围设定为O?36.0U/ml，各医院使用时可根据各地区标本的差异设定自己的参考值范围。
【权利要求】
1.一种人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分: 各固定浓度分别为 0U/ml、10U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml 的 CA125 蛋白标准品； 阳性质控品； 阴性质控品； ρΗ7.2的0.01M的磷酸缓冲液； 多克隆抗体稀释液； 包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板； 能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体的偶联体溶液； 25 X洗板液。
2.根据权利要求1所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，其中所述各固定浓度的CA125蛋白标准品的制备方法为:大量培养人卵巢癌细胞Ovcar-3，取细胞培养液，透析浓缩后使用分子筛分离出纯化的CA125蛋白，再使用pH7.2、浓度为 0.01M 的 PBS 缓冲液稀释成 OU/ml、10U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、1000U/ml o
3.根据权利要求2所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述纯化的CA125蛋白的制备方法如下: 步骤一:使用含10% FBS、3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3的DMEM完全培养液培养人卵巢癌细胞0vcar-3，37°C，5% CO2培养72小时； 步骤二:收集细胞培养液，使用细胞培养液体积20倍的pH7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液用截留分子量为5kD的透析袋透析，透析后再用含有30%的PEG-6000且pH7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液20倍浓缩； 步骤三:将步骤二浓缩后的细胞培养液以2ml/min的速度流过截留分子量为50_400kD的分子筛，使用快速蛋白纯化仪收集200kD左右的峰的蛋白，即为CA125蛋白。 步骤四:将收集的CA125蛋白20倍浓缩，方法同步骤二，得到纯化后的CA125抗原。
4.根据权利要求3所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为样品稀释液，所述样品稀释液为含1% BSA、0.05%的Tween-20且pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液；所述阳性质控品为将纯化后的CA125抗原用样品稀释液稀释成浓度为800U/ml的溶液；所述25X洗板液为含0.5% Tween-20且ρΗ7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液。
5.根据权利要求4所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体稀释液为含0.5%牛血清白蛋白、0.1%吐温-20且ρΗ7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于， 所述包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板的制备方法如下: 将鼠抗人CA125单克隆抗体用ρΗ7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液调整浓度为2 μ g/ml，酶标板每孔加100 μ 1，4°C孵育过夜，弃去包被液，然后加300 μ I/孔含0.1% Tween-20的PBST溶液洗涤三次，拍干；每孔再加入200μ I含0.1% TWeen-20、5%牛血清白蛋白且PH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液，即封闭液，4°C封闭过夜，弃去封闭液，然后加.300 μ I/孔含0.1 % Tween-20的PBST溶液洗涤三次，拍干。
7.根据权利要求6所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人CA125单克隆抗体的制备方法如下: 1)选用8~10周BALB/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前I~2周，先给小鼠腹腔注射.0.5ml弗氏不完全佐剂； 2)收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤I次，重悬于含3.5g/L Hepesl.9g/L NaHCO3的无血清的DMEM培养液中，调整细胞密度为I~2 X 106/ml，得到细胞悬液； 3)每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液，接种细胞7~12天，小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠头部，使腹水滴入离心管中；间隔2~3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2~3次，将收集到的腹水经3000rpm离心15min，弃去上层油脂、细胞成分和其他沉淀物，吸取淡黄色腹水；采用饱和硫酸铵沉淀法粗纯化以及亲和层析柱法纯化杂交瘤细胞腹水，得到浓度为1.2mg/ml的纯化后的鼠抗人CA125单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液的制备方法如下:取0.1mM的CdTeQDs600ul，加入18ul浓度为lmg/ml的二氯乙烷和800ul的甲醇混合后避光以800rpm震荡30min，再加入8ul的β -巯基乙醇进行终止即为活化后的QDs，取0.75mg的纯化后的鼠抗人CA125多克隆抗体血清用pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液稀释至4 μ g/ml,加入活化后的QDsIOuI中与之混合，避光800rpm震荡2小时，反应结束后再加入巯基乙醇20 μ I稳定量子点，然后用截留分子量为12kD的透析袋透析，透析后在16300Xg条件下离心3min，去除上清，得到沉淀，即为纯化的偶联有量子点的鼠抗人CA125多克隆抗体血清，将沉淀重悬于pH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液。
9.根据权利要求8所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒，其特征在于， 所述CdTeQDs的制备方法如下: 将2.5 XlO^moI的CdCl2.2.5H20溶于25ml的超纯水中，加入3 X 10_4mol的谷胱甘肽GSH、0.1 g 的二水合柠檬酸三钠、0.5X ΙΟΛιοΙ 的 Na2TeO3 和 2.4Χ ΙΟΛιοΙ 的 NaBH4,用磁力搅拌器以200rpm的条件下搅拌30分钟，在搅拌过程中用0.01M的NaOH调节PH至10.5，，搅拌完成后放入功率设为600 W的带回流的微波装置中，当溶液颜色变成淡绿色时开始回流，回流反应4h，随着回流时间的不同形成一系列不同粒径1-1Onm的以谷胱甘肽为稳定剂的量子点，将反应后的溶液冷却至室温后用两倍体积无水乙醇在4000rpm的条件下离心5min进行沉淀，去除上清中过量的Cd2+、Te032 —等杂质，同样条件重复3遍，待乙醇完全挥发后，将沉淀重悬于的PH7.2、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到0.1mM的CdTeQDs ； 所述纯化后的鼠抗人CA125多克隆抗体血清的制备方法如下: 1)动物免疫 将上述纯化后的CA125抗原10000U溶入Iml pH7.2、浓度为0.01M的磷酸缓冲溶液中得到抗原溶液，在Iml弗氏不完全佐剂中加入灭活的结核分枝杆菌制成弗氏完全佐剂，并加入上述Iml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化得到抗原乳化液，用3ml注射器抽取该抗原乳化液，对兔子进行注射抗原乳化液，并进行若干次加强免疫； .2)收集抗血清 在加强免疫注射后的7~10天收集血液，待确定产生抗体后大量收集血液，将血液置于37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C静置过夜，用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10，OOOg离心10分钟，收集上清液即为抗血清； .3)抗体纯化 在抗血清中加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%,4°C,15, OOOg离心5分钟，移出上清液再经0.45 μ m的过滤器过滤除去多余的脂，将过滤除去多余的脂的抗血清用pH7.4且浓度为0.1M的TBS缓冲溶液以1:5的体积比进行稀释，再用0.45 μ m的过滤器进行过滤，以.0.5ml/min的速度将过滤后的抗血清-TBS缓冲溶液上到GElml Protein A Sepharose预装柱上，连续上柱2次并保留上样流出液，用pH7.4且浓度为0.1M的TBS缓冲溶液清洗柱子至Αλ28_〈0.008后再用ρΗ4.5、浓度为0.1M的甘氨酸-HCl以0.5ml/min的速度洗脱，洗脱液立即转至PH7.2且浓度为0.01M的PBS缓冲液中透析过夜，按上述方法收集洗脱液至Αλ 280ΠΙ1<0.008 ，得到纯化后的兔抗人CA125多克隆抗体血清。
10.根据权利要求1-9任一项所述的人CA125蛋白量子点标记的双夹心免疫分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一:取包被有鼠抗人CA125单克隆抗体的酶标板，室温放置30min ； 步骤二:以100μ I/孔待测样品加入步骤一中酶标板的板条孔中，同时用阴性质控品.100 μ I作阴性对照、用阳性质控品100 μ I作阳性对照、各固定浓度的CA125蛋白标准品.100 μ I分别加入到步骤一中酶标板的板条孔中，37°C反应I小时后用25 X洗板液经过25倍稀释后的溶液冲洗3次，每次3min，拍干； 步骤三:用多克隆抗体稀释液将能与CA125蛋白特异性结合的CdTe量子点与鼠抗人CA125多克隆抗体血清的偶联体溶液1:10000稀释，每孔加入100 μ L，37°C反应I小时后用用25 X洗板液经过25倍稀释后的溶液冲洗3次，拍干，然后加入100 μ L的ρΗ7.2的0.01M的磷酸缓冲液； 步骤四:将处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值，通过CA125蛋白标准品的荧光强度值及相应的浓度建立标准曲线，得到r值大于0.990的检测线，阴性质控品及阳性质控品数值均在线性范围内，计算样品含量。
【文档编号】G01N33/68GK103983791SQ201410232892
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】夏曦, 郭忠正, 卢运萍, 罗红志, 杨绘 申请人:深圳市柏明胜医疗器械有限公司, 深圳市昌红科技股份有限公司