一种ssr扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及装置，本装置用三块玻璃板采用3夹2的夹心式组合方式，将分离胶同时倒入三块玻璃板之间形成的两个夹层之间，一次灌胶可以制成两块分离胶版。由于两块带有方形缺口的玻璃板凹下的尺寸不同，形成凝胶后两个胶版的点样孔的高度不同，点样时不容易发生错误，避免应该点在一个胶版上的样品错误的点到另外一个胶版上。本发明一次灌胶可以同时制作两块胶版，配胶、灌胶过程和常规的一次只能灌一块胶相比工作效率提高30％以上。在后续的固定、染色、定影、显影过程中，一次处理的胶版数量较常规方法增加，总体可以节省电极缓冲液、显影液、染色液、固定液等用量30％左右。
【专利说明】—种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学【技术领域】，涉及一种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及装置。
【背景技术】
[0002]凝胶电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在生化实验室和生化工业方面应用更为普通；医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。现有方法一次灌胶只能制作I块垂直板凝胶电泳胶版，I个普通垂直板凝胶电泳槽最多可以同时电泳2快胶版。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及装置，采用本装置可以同时制作2块胶，I个普通垂直板凝胶电泳槽最多可以同时电泳4快胶版，电泳槽利用效率提高I倍，提高工作效率30%以上。其具体技术方案为:
[0004]一种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，包括以下步骤:
[0005]I聚丙烯酰胺凝胶制备:
[0006]1.1清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；
[0007]1.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物(柱状玻璃体垫块等)上，给玻璃板滴少量100 %乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干，浅凹玻璃板先用酒精擦洗一面，气干后翻转，再擦拭另一面气干；
[0008]1.3平口玻璃板和凹口玻璃板的二个短边均匀的涂抹适量凡士林；
[0009]制作胶版时先把玻璃板放在垫块上,然后在靠近其两个短边的边缘分别放上一个胶条，胶条短边和没有凹口的玻璃板底边放齐，长边玻璃板的短边平行，用手将胶条按牢固，在两个胶条上面放上浅凹玻璃板，然后同样地在靠近玻璃板短边边缘分别放上一个胶条，用手按牢，然后再把深凹玻璃板放在胶条上；要求两块凹口玻璃板的缺口在同一方向上，三块玻璃板的另外三个边叠放整齐；这样在三块玻璃板之间就形成了两个夹层，最后用夹子固定；
[0010]1.4配胶、灌胶:
[0011]将以下母液按量混合均匀保存于4°C，一般一周内用完，
[0012]
【权利要求】
1.一种SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)聚丙烯酰胺凝胶制备: . 1.1清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)； .1.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物(柱状玻璃体垫块等)上，给玻璃板滴少量100 %乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干，浅凹玻璃板先用酒精擦洗一面，气干后翻转，再擦拭另一面气干； .1.3平口玻璃板和凹口玻璃板的二个短边均匀的涂抹适量凡士林； 制作胶版时先把玻璃板放在垫块上，然后在靠近其两个短边的边缘分别放上一个胶条，胶条短边和没有凹口的玻璃板底边放齐，长边玻璃板的短边平行，用手将胶条按牢固，在两个胶条上面放上浅凹玻璃板，然后同样地在靠近玻璃板短边边缘分别放上一个胶条，用手按牢，然后再把玻璃板放在胶条上；要求两块凹口玻璃板的缺口在同一方向上，三块玻璃板的另外三个边叠放整齐；这样在三块玻璃板之间就形成了两个夹层，最后用夹子固定; 1.4配胶、灌胶: 将以下母液按量混合均匀保存于4°C，一般一周内用完，溶液120ml240ml40%Acr24ml48ml2%Bis12.84ml25.68ml10XTBE12ml24mlddH20 70.8ml141.6ml 针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10% APS和TEMED，摇匀，在平放状态下，将配好的分离胶从凹口边倒入两个夹层中，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固； (2)电泳 . 2.1在电泳槽防止缓冲液下渗的橡胶条上均匀涂抹适量凡士林，用来防止上槽缓冲液渗入下槽，往上下电泳槽先加入适量Ix TBE电泳缓冲液； . 2.2胶凝固后，拔去梳子，并用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子将玻璃板固定于电泳槽上，再加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电泳缓冲液冲洗点样孔； . 2.3向10 μ LPCR扩增样品中加入2μ L的5x Loading dye，每个样品点10-12 μ L ;最后点 Marker DNA ； . 2.4恒压或恒流电泳，恒流；电泳2个胶板，电流设置为100-.120mA，电压约300-400V ；电泳4个胶板，电流设置为200-240mA，电压约300-400V ;但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲； (3)银染显色.3.1当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭电泳仪，移去夹子，取下玻璃板，将两层胶分别从玻璃板上小心取下，然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤如下: 首先在固定液(10%醋酸)中固定20分钟，然后用去纯水冲洗15分钟，放到染色液.0.2%硝酸银中染色30分钟，用纯水冲洗10-20秒，放到显影液中适当显影，然后放到定影液10%乙酸中定影5分钟,定影结束后照相； . 3.2银染中应注意事项: .3.2.1水的质量对染色效果影响极大，一般用超纯水或双蒸水，如果水含有污染物，胶可能不显影或仅仅显上部条带；而下部空白； .3.2.2显影液中碳酸钠的纯度也很重要，建议使用无水碳酸钠； .3.2.3由于温度过高，显影太快，所以为了便于控制显影过程，一般将显影液储存于.4°C，用时取出；显影液在4°C长期放置容易结晶，一般使用前1-2天配制即可，显影液配制方法如下:首先称取Na2CO3 (无水碳酸钠)100克，然后量取50mg/ml硫代硫酸钠160微升，然后加入甲醛2毫升，定容到1000毫升； .3.2.4在10%的定影液加入几滴甘油，用作最后的显影液； .3.2.5每一步都应该轻 轻摇动，一般在摇床上进行； .3.2.6银染后在无离子水中的冲洗时间要求十分严格，一般在10秒左右，应小于20秒，如果超过20秒，应重新在0.2%的硝酸银重新染30分钟； .3.2.7 0.2%的硝酸银溶液可以重复使用3-4次，每次适当延长银染时间； .3.2.8因为不容易清洗，所以装硝酸银、显影液和固定液及定影液的盆不能混用； . 3.2.9电泳结束后，涂抹凡士林的玻璃板、板条用热水浸泡后，用纸擦去凡士林，再清洗时比较容易洗净，或浸泡后用洗洁精清洗即可； (4)照相 用凝胶成像分析仪照相或干胶扫描。
2.根据权利要求1所述的SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，其特征在于， (I)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩；(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡；(3)样品模板梳齿应平整光滑；(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过；(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲；(6)板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量)；(7)制胶用玻璃板应为硫化玻璃；(8)两个胶版的点样孔的高度相差只有0.5cm,点样时应注意，避免应该点在一个胶版上的样品错误的点到另外一个胶版上；(9)由于同时电泳的胶版数较多，要把Marker点在不同的泳道上，以区别不同的胶版；(10)恒压或恒流电泳，恒流；电泳2个胶板，电流设置为100-120mA，电压约.300-400V ;电泳4个胶板，电流设置为200-240mA，电压约300-400V ;但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲。
3.一种实现权利要求1所述的SSR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法的装置，其特征在于，包括玻璃板3块，胶条4个，梳子I个，夹子2个； 所用三块玻璃板外形尺寸长和宽都相同，矩形玻璃板尺寸为20cmX 17cm ;浅凹玻璃板为在一个长边上有一下凹1.5cmX 17cm的缺口 ；深凹玻璃板有一下凹2.0cmX 17cm的缺口，玻璃板的厚度都为3mm ;胶条长度为18cm，宽带为1cm，厚度根据需要制作的胶版厚度调整，一般为1mm ;梳子的厚度要和胶条的厚度相同，齿数有15、20、40之别，根据实验要求选择；制作胶版时先把矩形玻璃板放在垫块上，然后在其两个短边靠近边缘位置分别放上一个胶条，胶条短边和没有凹口的玻璃板底边放齐，长边玻璃板的短边平行，在两个胶条上面放上浅凹玻璃板，然后同样地在靠近浅凹玻璃板短边边缘分别放上一个胶条，然后再把深凹玻璃板放在胶条上；要求两块凹口玻璃板的缺口在同一方向上，三块玻璃板的另外三个边叠放整齐，这样在三块玻璃板之间就形成了两个夹层，最后用两个夹子分别夹在叠在一起的三块玻璃板的两个短边中间位置；在平放状态下，将配好的分离胶从凹口边倒入两个夹层中，插 上梳子，待浓缩胶聚合完全后，放在支撑架上，用夹子夹住固定，轻轻地拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔，就可以形成具有两块分离胶的胶版；以同样的方式制作另外一快胶版，分别放在垂直板电泳槽的两边，用夹子夹紧，往电泳槽的上下缓冲液室里加入电极缓冲液，将样品用微量进样器点入样品孔底部，进行电泳。
【文档编号】G01N27/447GK103995039SQ201410234799
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】王霖, 李兴峰, 鲍印广, 李君 , 丁安明 申请人:济宁市农业科学研究院, 山东农业大学