一种测定多糖糖组分的分析方法
【专利摘要】本发明属于多糖的定性和定量分析【技术领域】，具体涉及一种测定多糖组分的分析方法。所述测定多糖糖组分的分析方法包括如下步骤：将待测多糖与离子液在油浴锅中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷却后倒入再生溶剂中得到沉淀，反复冲洗，离心得到再生多糖粗产品，通风使残余再生溶剂完全挥发，干燥后得到再生多糖；将所得再生多糖与酸溶剂置于安培瓶中并密封，将安培瓶放入油浴锅中进行水解反应，水解反应结束后进行离心，取上清液进行检测前处理，得到多糖检测液；采用离子色谱仪系统，应用离子色谱-脉冲安培法分析多糖检测液中糖组分的还原糖种类和含量。本发明分析方法提高了多糖的水解效率，且具有极高的灵敏度。
【专利说明】一种测定多糖糖组分的分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多糖中糖组分的定性和定量分析【技术领域】，具体涉及一种测定多糖糖组分的改进分析方法。
【背景技术】
[0002]多糖是自然界中含量最丰富的物质之一，对维持生命活动起着至关重要的作用。在生命过程中，多糖不仅作为能量物质和结构物质，而且还具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、免疫调节及降血糖等多种生物活性，广泛地应用于保健食品、医药和临床上。
[0003]多糖结构分析对于多糖研究十分重要:揭示多糖构效关系、开发新型功能多糖。然而，鉴于高分子多糖的复杂性，没有直接仪器手段解析多糖结构，目前，常用的方法，均需要将多糖降解为单糖来分析，因此，多糖的糖组成分析方法包括两个步骤:多糖酸水解为含单糖的水解液及色谱法检测分析单糖。酸水解是将多糖降解为单糖的主要方法，是多糖结构分析的必要步骤。然而，多糖是一个高结晶度的高分子聚集体，结晶多糖分子排列紧密，由于多糖分子聚集体内腔的疏水作用以及分子间的空间位阻，酸在糖聚集体中渗透慢，导致水解时间延长，因此，多糖水解是一个高温强酸性条件下的长时间的化学过程；另一方面，在特定酸性条件下，不同的单糖残基水解程度不同，位于支链的糖苷键较主链的糖苷键易于水解，呋喃糖较吡喃糖易于水解；与糖醛酸相连的则糖苷键难水解鉴于天然多糖大部分为非均一的杂多糖，以上易水解和难水解的结构共存，这造成两方面的矛盾，一方面，易于水解的部分，单糖很快释放出来；另一方面，难降解部分仍需要高温强酸下长时间处理，这导致已经水解的单糖由于受到长时间高温强酸的作用，发生降解，水解液颜色较深，从而产生损失，不利于定量分析。因此，目前多糖糖组份分析的前期酸水解液普遍存在未水解残渣多、水解液颜色深，有新的糖衍生物等干扰物生成，不利于后续的色谱分析。可见，破坏高结晶多糖的网状骨架，降低分子结晶度将是提高酸水解效率的关键。
[0004]离子液体是近年来兴起的一种十分具有良好应用前景的绿色溶剂。Rogers研究组首先发现了氯化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM]C1)可溶解自然界中最为广泛的多糖纤维素，Dadi等研究表明，纤维素经[BMM]Cl离子液体预处理后可提高糖化速度。鉴于以上研究结果，将离子液应用于多糖水解的预处理，将降低多糖的结晶度，促进酸在多糖分子间的渗透，从而缩短水解时间，避免已水解单糖破坏。
[0005]目前报道单糖测定的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、亲和色谱、酶学法和毛细管电泳法等，这些分析方法普遍灵敏度不高、分离效果差，目前通用的方法是气相色谱法，它解决了以上仪器部分分离单糖各种同分异构体的问题，但是该方法需要进行复杂的衍生化处理，同时，衍生化过程中还造成单糖的损失，给定量分析带来困难。离子色谱-脉冲安培检测糖是近年发展起来的新方法，该方法无需衍生，就能分析几乎所有的单糖和大部分寡糖及低聚糖，操作简便，无需复杂样品前处理，更无需衍生，而且具有极高的灵敏度，通常可以检测到pmoL级的糖类物质，但结合酸水解分析高结晶度的多糖中糖组分和含量，尚未见报道。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的在于提供一种联合离子液预处理、酸溶剂处理及离子色谱-脉冲安培检测法定性和定量分析高结晶多糖的单糖组分的方法。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]一种测定多糖糖组分的分析方法，包括以下步骤:
[0009](I)离子液预处理及多糖再生:将待测多糖与离子液在油浴锅中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷却后倒入再生溶剂中得到沉淀，反复冲洗，离心得到再生多糖粗产品，通风使再生多糖粗产品内残余的再生溶剂完全挥发，干燥后得到再生多糖；
[0010]所述待测多糖为目前常规的多糖类型，尤其可为高结晶的多糖，优选的为酵母β-葡聚糖、虫草多糖、凝结多糖或龙胆多糖中的一种；
[0011]优选的，所述离子液为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([Bmim] Cl)、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([Emim] Ac)、1-烯丙基或3-甲基咪唑氯盐([Amim] Cl)中的一种以上；
[0012]优选的，所述待测多糖与离子液的质量比为1: (15?25)；
[0013]优选的，所述充分溶解的条件为:溶解温度为80?100°C，溶解时间为2?4h ;
[0014]优选的，所述多糖溶解液冷却后的温度为50°C ；
[0015]优选的，所述再生溶剂为无水乙醇或水；
[0016]优选的，所述再生溶剂的用量为离子液体积的5?10倍；
[0017]优选的，所述干燥的条件为:干燥温度为50?80°C，真空度为0.05?0.lKPa，干燥时间为2?5h ;
[0018](2)酸溶剂水解:将步骤(I)所得再生多糖与酸溶剂混合置于安培瓶中并密封，将密封后的安培瓶放入油浴锅中进行水解反应，水解反应结束后进行离心，取上清液进行检测前处理，得到多糖检测液；
[0019]优选的，所述酸溶剂为三氟乙酸(TFA)、硫酸或盐酸中的一种以上；
[0020]优选的，所述酸溶剂的浓度为2?4mol/L ；
[0021]优选的，所述酸溶剂的用量为:每g再生多糖对应使用IOmL的酸溶剂；
[0022]优选的，所述水解反应的条件为:反应温度为70?120°C，反应时间为2?4h ;
[0023]优选的，所述离心的条件为:转速为7000r/min，时间为IOmin ；
[0024]优选的，所述检测前处理的具体步骤为:用超纯水对上清液进行定容，稀释后过
0.2 μ m滤膜；
[0025](3)离子色谱-脉冲安培法(HPAEC-PAD)检测单糖组分:采用离子色谱仪系统，应用离子色谱-脉冲安培法分析多糖检测液中单糖组分的还原糖种类和含量；
[0026]优选的，所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mmX250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mmX50mm),柱温30°C,流动相流速固定在
1.0mL/min,进样体积固定在20 μ L ;
[0027]其中，所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L的NaOH溶液以二元梯度淋洗方式进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0028]本发明的原理:
[0029]本发明利用离子液中含有较强的氢键受体Cl-或Ac-与待测多糖分子上的羟基形成氢键，同时带有强极性基团的咪唑阳离子也对待测多糖氢键的破坏发挥了很大的促进作用，溶剂离子与待测多糖分子直接发生较强的氢键作用，从而减小结晶多糖分子内与分子间氢键，待测多糖原有的结晶结构遭到破坏，促进酸与待测多糖之间的渗透与传质，提高待测多糖的水解效率。
[0030]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0031](I)离子液作为有效的绿色溶剂，具有不挥发性、易于回收和再利用等优点，而且对环境无污染，可以降低生产成本，节约资源和能源，且能破坏高结晶多糖的结构，使之易水解。
[0032](2)咪唑型离子液中较高的阴浓度和阳离子活性可以有效的破坏溶质中的氢键作用，使得水解后溶液比直接酸化或超声等物理方式预处理再酸水解的颜色更浅，单糖和寡糖含量闻，不易损失。
[0033](3)离子色谱-脉冲安培检测定性和定量分析高结晶多糖糖组分的方法操作简便，无需复杂样品前处理，更无需衍生，而且具有极高的灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为实施例2方法处理得到的虫草多糖检测液的离子色谱图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0036]实施例1
[0037]—种测定多糖糖组分的方法，具体步骤如下:
[0038]1、离子液预处理及多糖再生:称取0.2g在70°C真空度为0.098kPa的真空干燥箱中恒温干燥2h的酵母β -葡聚糖，与4g的再生溶剂[BMM]C1混合在油浴锅中充分溶解2h，得到酵母β -葡聚糖溶解液；将酵母β -葡聚糖溶解液加入到5倍离子液容积的无水乙醇中再生，反复冲洗，离心沉降，得到再生酵母β-葡聚糖粗产品，将再生酵母β-葡聚糖粗产品置于通风橱中充分挥发再生溶剂，再在温度50°C、真空度0.1KPa环境中干燥时间5h后得到再生酵母β-葡聚糖；
[0039]2、酸溶剂水解:将步骤I所得再生酵母β -葡聚糖与2ml的4moL/L的TFA混合放入安培瓶中并密封，于油浴锅中100°c下水解4h后，转速7000r/min离心IOmin后取上清液，将上清液用超纯水定容至IOOmL,稀释10倍后过0.2 μ m的滤膜，得到多糖检测液；
[0040]3、HPAEC-PAD检测:用离子色谱-脉冲安培法对对照组溶液及步骤2所得的多糖检测液进行检测分析多糖中糖组分的还原糖种类和含量；所述对照组溶液为将同样的酵母β -葡聚糖不经过步骤I的离子液预处理及多糖再生，而是直接进行步骤2的酸溶剂水解处理得到的检测液；
[0041]所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mm X 50mm),柱温30 °C,流动相流速固定在1.0mL/min，进样体积固定在20 yL ;所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式来进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0042]经过HPAEC-PAD定性和定量分析，对照组溶液中的酵母β-葡聚糖还原糖为55.23g/100g，本发明方法所得多糖检测液多糖中酵母β_葡聚糖还原糖含量提高了17.2g/100g ;经本发明方法得到的多糖检测液中葡萄糖含量比对照组溶液的葡萄糖含量增加了 44.5%;对照组溶液中葡萄糖浓度为691.6mg/L，本发明方法所得多糖检测液中葡萄糖浓度达到999.4mg/Lo
[0043]用比色管观察对照组溶液及本发明方法处理所得的酵母β -葡聚糖检测液，对照组溶液呈淡黄褐色，酵母β_葡聚糖检测液呈澄清。
[0044]实施例2
[0045]一种测定多糖糖组分的方法，具体步骤如下:
[0046]1、离子液预处理及多糖再生:称取0.2g在50°C真空度为0.098kPa的真空干燥箱中恒温干燥3h的虫草多糖，与3g的再生溶剂[Emim]Ac混合在油浴锅中充分溶解3h，得到虫草多糖溶解液；将虫草多糖溶解液加入到10倍离子液容积的去离子水中再生，反复冲洗，离心沉降，得到再生虫草多糖粗产品，将再生虫草多糖粗产品置于通风橱中充分挥发再生溶剂，再在温度75°C、真空度0.0SKPa环境中干燥时间4h后得到再生虫草多糖；
[0047]2、酸溶剂水解:将步骤I所得再生虫草多糖与2mL的2mol/L的H2SO4溶液放入安培瓶中并密封，于油浴锅中100°c下水解2h后，转速7000r/min离心IOmin后取上清液，将上清液用超纯水定容至IOOmL,稀释10倍后过0.2 μ m的滤膜，得到多糖检测液；
[0048]3、HPAEC-PAD检测:用离子色谱-脉冲安培法对对照组溶液及步骤2所得的多糖检测液进行检测分析多糖中糖组分的还原糖种类和含量；所述对照组溶液为将同样的虫草多糖不经过步骤I的离子液预处理及多糖再生，而是直接进行步骤2的酸溶剂水解处理得到的检测液；
[0049]所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mm X 50mm),柱温30 °C,流动相流速固定在1.0mL/min，进样体积固定在20 yL ;所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式来进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0050]经过HPAEC-PAD定性和定量分析，对照组溶液中的多糖水解产物中糖组分主要有葡萄糖和甘露糖，此外还有少量的麦芽糖和麦芽三糖，而本发明方法得到的多糖检测液中麦芽糖和麦芽三糖未检出。对照组溶液中虫草多糖还原糖为44.23g/100g,本发明方法所得多糖检测液中虫草多糖还原糖含量提高了 18.20g/100g ;本发明方法处理后的多糖检测液检出葡萄糖含量比对照组溶液中的葡萄糖含量增加了 68.9% ;对照组溶液中葡萄糖浓度为540.2mg/L，本发明方法处理所得的多糖检测液中葡萄糖浓度达到912.3mg/L。[0051]本实施例方法处理得到的虫草多糖检测液的离子色谱图如图1所示。
[0052]用比色管观察对照组溶液及本发明方法处理所得的虫草多糖检测液，对照组溶液呈淡黄褐色，虫草多糖检测液呈澄清。
[0053]实施例3
[0054]一种测定多糖糖组分的方法，具体步骤如下:
[0055]1、离子液预处理及多糖再生:称取0.2g在60°C真空度为0.098kPa的真空干燥箱中恒温干燥4h的凝结多糖，与5g的再生溶剂[Amim]Cl混合在油浴锅中充分溶解4h，得到凝结多糖溶解液；将凝结多糖溶解液加入到5倍离子液容积的无水乙醇中再生，反复冲洗，离心沉降，得到再生凝结多糖粗产品，将再生凝结多糖粗产品置于通风橱中充分挥发再生溶剂，再在温度80°C、真空度0.05KPa环境中干燥时间2h后得到再生凝结多糖；
[0056]2、酸溶剂水解:将步骤I所得再生凝结多糖与2mL的4mol/L的盐酸溶液放入安培瓶中并密封，于油浴锅中100°c下水解4h后，转速7000r/min离心IOmin后取上清液，将上清液用超纯水定容至IOOmL,稀释10倍后过0.2 μ m的滤膜，得到多糖检测液；
[0057]3、HPAEC-PAD检测:用离子色谱-脉冲安培法对对照组溶液及步骤2所得的多糖检测液进行检测分析多糖中糖组分的还原糖种类和含量；所述对照组溶液为将同样的凝结多糖不经过步骤I的离子液预处理及多糖再生，而是直接进行步骤2的酸溶剂水解处理得到的检测液；
[0058]所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mm X 50mm),柱温30 °C,流动相流速固定在1.0mL/min，进样体积固定在20 yL ;所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式来进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0059]经过HPAEC-PAD定性和定量分析，对照组溶液的多糖水解产物中糖组分主要为葡萄糖，还有少量的麦芽糖和麦芽三糖，此外存在痕量的低聚糖等其它糖，而本发明方法处理得到的多糖检测液中麦芽糖和麦芽三糖未检出；对照组溶液中凝结多糖还原糖为53.67g/100g，本发明方法所得多糖检测液中凝结多糖还原糖含量提高了 19.72g/100g ；本发明方法处理后的多糖检测液检出葡萄糖含量比对照组溶液中的葡萄糖含量增加了68.32% ;对照组溶液中葡萄糖浓度为552.6mg/L，本发明方法处理所得的多糖检测液中葡萄糖浓度达到930.lmg/L。
[0060]用比色管观察对照组溶液及本发明方法处理所得的凝结多糖检测液，对照组溶液呈浅黄褐色，凝结多糖检测液呈澄清。
[0061]实施例4
[0062]一种测定多糖糖组分的方法，具体步骤如下:
[0063]1、离子液预处理及多糖再生:称取0.2g在70°C真空度为0.098kPa的真空干燥箱中恒温干燥3h的龙胆多糖，与4g的再生溶剂[BMM]C1混合在油浴锅中充分溶解2h，得到龙胆多糖溶解液；将龙胆多糖溶解液加入到5倍离子液容积的无水乙醇中再生，反复冲洗，离心沉降，得到再生龙胆多糖粗产品，将再生龙胆多糖粗产品置于通风橱中充分挥发再生溶剂，再在温度70°C、真空度0.06KPa环境中干燥时间3h后得到再生龙胆多糖；
[0064]2、酸溶剂水解:将步骤I所得再生龙胆多糖与2mL的2mol/L的三氟乙酸溶液放入安培瓶中并密封，于油浴锅中100°c下水解2h后，转速7000r/min离心IOmin后取上清液，将上清液用超纯水定容至IOOmL,稀释10倍后过0.2 μ m的滤膜，得到多糖检测液；
[0065]3、HPAEC-PAD检测:用离子色谱-脉冲安培法对对照组溶液及步骤2所得的多糖检测液进行检测分析多糖中糖组分的还原糖种类和含量；所述对照组溶液为将同样的龙胆多糖不经过步骤I的离子液预处理及多糖再生，而是直接进行步骤2的酸溶剂水解处理得到的检测液；
[0066]所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mm X 250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mm X 50mm),柱温30 °C,流动相流速固定在
1.0mL/min，进样体积固定在20 yL ;所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L NaOH溶液以二元梯度淋洗方式来进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
[0067]经过HPAEC-PAD定性和定量分析，对照组溶液的多糖水解产物中糖组分主要为葡萄糖，还有少量的麦芽糖和麦芽三糖，此外存在痕量的低聚糖等其它糖，而本发明方法处理得到的多糖检测液中麦芽糖和麦芽三糖含量明显低于对照组溶液中的含量；对照组溶液中龙胆多糖还原糖为58.13g/100g，本发明方法处理所得多糖检测液中龙胆多糖还原糖含量提高了 15.43g/100g ;本发明方法处理后的多糖检测液检出葡萄糖含量比对照组溶液中的葡萄糖含量增加了 54.38% ;本发明方法处理后的多糖检测液检出甘露糖含量比对照组溶液中甘露糖含量增加了 57.24%。
[0068]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种测定多糖糖组分的分析方法，其特征在于包括以下步骤: (1)离子液预处理及多糖再生:将待测多糖与离子液在油浴锅中充分溶解得到多糖溶解液，待所述多糖溶解液冷却后倒入再生溶剂中得到沉淀，反复冲洗，离心得到再生多糖粗产品，通风使再生多糖粗产品内残余的再生溶剂完全挥发，干燥后得到再生多糖； (2)酸溶剂水解:将步骤(I)所得再生多糖与酸溶剂混合置于安培瓶中并密封，将密封后的安培瓶放入油浴锅中进行水解反应，水解反应结束后进行离心，取上清液进行检测前处理，得到多糖检测液； (3)离子色谱-脉冲安培法检测单糖组分:采用离子色谱仪系统，应用离子色谱-脉冲安培法分析多糖检测液中单糖组分的还原糖种类和含量。
2.根据权利要求1所述的测定多糖糖组分的分析方法，其特征在于在步骤(I)中: 所述离子液为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-烯丙基或3-甲基咪唑氯盐中的一种以上； 所述待测多糖与离子液的质量比为1: (15?25)； 所述充分溶解的条件为:溶解温度为80?100°C，溶解时间为2?4h ; 所述多糖溶解液冷却后的温度为50°C ； 所述再生溶剂为无水乙醇或水； 所述再生溶剂的用量为离子液体积的5?10倍； 所述干燥的条件为:干燥温度为50?80°C，真空度为0.05?0.1KPa,干燥时间为2?5h。
3.根据权利要求1所述的测定多糖糖组分的分析方法，其特征在于在步骤(2)中: 所述酸溶剂为三氟乙酸、硫酸或盐酸中的一种以上； 所述酸溶剂的浓度为2?4mol/L ； 所述酸溶剂的用量为:每g再生多糖对应使用IOmL的酸溶剂； 所述水解反应的条件为:反应温度为70?120°C，反应时间为2?4h ; 所述离心的条件为:转速为7000r/min,时间为IOmin ； 所述检测前处理的具体步骤为:用超纯水对上清液进行定容，稀释后过0.2μπι滤膜。
4.根据权利要求1所述的测定多糖糖组分的分析方法，其特征在于在步骤(3)中:所述离子色谱仪系统采用在线脱气装置的梯度泵，配25 μ L进样环的柱温箱、自动进样器和配有薄膜型安培池的电化学检测器，色谱柱采用CarboPacTM PAl分析柱(4mmX250mm)和CarboPacTM PAl保护柱(4mmX 50mm),柱温30°C,流动相流速固定在1.0mL/min,进样体积固定在20 μ L0
5.根据权利要求4所述的测定多糖糖组分的分析方法，其特征在于:所述离子色谱仪系统中色谱柱的淋洗条件为:水和300mmoL/L的NaOH溶液以二元梯度淋洗方式进行色谱分离，在最初的20min，采用体积分数为95%水和5%的300mmoL/L的NaOH溶液二元混合液等度淋洗方式，然后以台阶改变方式在0.1min内将淋洗液变为100%的300mmoL/L NaOH溶液，并保持25min。
【文档编号】G01N27/48GK104007201SQ201410236122
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】王兆梅, 廖伟, 李满凤 申请人:华南理工大学