一种液相色谱-酶电极联用装置及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种液相色谱-酶电极联用装置，该装置包括色谱分离单元、检测器、有机溶剂去除单元、活性评价单元和计算机，色谱分离单元包括依次通过管路相互连接的流动相储罐、色谱泵、进样阀和液相色谱柱，液相色谱柱通过管路连接所述的检测器；有机溶剂去除单元用于去除样品中的有机溶剂，有机溶剂去除单元的前端连接检测器；活性评价单元包括混合器、缓冲液储罐和酶电极，混合器与有机溶剂去除单元的后端相连接，缓冲液储罐连接至混合器，混合器连接至酶电极；计算机分别电连接所述的检测器与酶电极。本发明能够在线、实时提供分析样品中各成分的生物活性，实现分析待测样品中的成分组成并在线评价各组分对应的生物活性。
【专利说明】—种液相色谱-酶电极联用装置及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种属于药物领域，尤其涉及一种液相色谱-酶电极联用装置及中药成分-活性在线分析应用。
【背景技术】
[0002]随着中药产业规模的扩大及中药研究成果的发展，中药分析技术取得了极大进展，中药分析的对象更集中于针对中医药现代化研究中的关键科学问题；同时中药分析需要将各种新方法、新技术整合使之成为解决关键科学问题的新体系，而不再局限于分析中药的物质组成，更注重解决的是物质的组成及其功能的相关性。整体系统生物学(GlobalSystems Biology)的发展,系统揭示化学物质组的变化与生物系统应答的时空响应的相关性；以及基于代谢组学的方药指纹-药代标示物-药效靶标三维模式的中药复方代谢的研究设想，均体现了改进现有中药分析新技术，整合分析方法应用的发展趋势。
[0003]中药成分分析技术在以往的液相色谱、气相色谱、薄层色谱的基础上，发展了气相-质谱联用、液相-质谱联用乃至色谱-核磁联用等技术，在对中药复杂成分进行分离分析的同时提供了丰富的结构信息，实现了中药中已知或未知成分的定性定量分析，极大地推进了中药成分化学研究，但是现有的分析技术均以化学成分研究为目的，无法在线反应或评价成分的生物活性。因此，选择与中药功效相关的酶蛋白分子，通过物理化学交联作用固定化做成固定化酶膜，然后与电化学传感器结合构成酶电极(enzyme electrode),利用酶反应的专一性、稳定性以及电化学分析的快速、灵敏，在线、实时提供分析样品中各成分的生物活性。酶电极联合液相分析，能够突破现有分析技术中成分活性信息的缺失，为建立新的中药质量评价模式提供思路和技术方案。
[0004]电极分析法(包括酶电极)作为一种电化学检测手段，已经成功实现与离子色谱的在线联用。但由于液相色谱流动相中有机溶剂的存在，限制了酶电极与液相色谱的联用。若将有机溶剂去除装置连接于液相色谱和酶电极之间，将流动相中有机溶剂去除，则可实现液相色谱与酶电极的联用。
[0005]在色谱分析中，浓缩富集是样品的常规前处理手段，即在样品进色谱柱分离之前进行浓缩富集。也有柱后浓缩富集的，比如液相色谱-质谱联用法(LC-MS)及液相色谱-蒸发光散射法(LC-ELSD)，但它们都是质量型检测器而非浓度型检测器。若在常规浓度型检测器之后连接一个溶剂去除装置，采用具有多孔性和疏水性的多孔聚四氟乙烯膜及中空纤维膜作为渗透膜，允许有机溶剂渗透，能够实现溶剂去除，并达到样品组分的浓缩目的，为进一步的活性评价提供基础。有机溶剂去除装置设计:流动相通过多孔渗透膜管时，在管壁外围流过已加热的干燥气体(比如空气或氮气)，有机溶剂受热挥发为气态，透过渗透膜去除。
[0006]中药成分组成复杂，常规的分析技术在中药的定性、定量分析中发挥了中药作用，但目前尚未见能够同时提供中药成分组成与组分一一对应的活性信息的分析方法。本发明专利以小型化固定化酶电极为活性评价靶标，通过色谱分离-检测器-在线溶剂去除-酶电极检测各部件的整合，形成中药在线成分-活性评价实验装置，并利用该装置，开展白术的中药成分-活性在线评价应用。分析结果将同时提供中药成分组成信息以及与酶电极作用的活性信息，该在线分析结果，结合化学成分鉴定结果，将全面提供白术成分-活性信息，能够为阐述白术药效作用机制提供新的技术方法。同时该技术能够推广应用至其他中药，能够进一步加强与中医理论相结合的有效成分研究，最终建立一种新的以成分、活性为综合指标的中药质量评价体系，通过加强质控，提高中药材质量，促进中药产业发展。
【发明内容】
[0007]为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种液相色谱-酶电极联用装置，通过该装置可以得到待测样品中的成分组成信息，并进一步明确各组分对应的酶结合活性，得到成分-活性在线评价结果。本发明的另外一个目的是提供采用上述的装置进行中药成分-活性在线分析的方法。
[0008]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种液相色谱-酶电极联用装置，该装置包括色谱分离单元、检测器、有机溶剂去除单元、活性评价单元和计算机，所述的色谱分离单元包括依次通过管路相互连接的流动相储罐、色谱泵、进样阀和液相色谱柱，液相色谱柱通过管路连接所述的检测器；所述的有机溶剂去除单元用于去除样品中的有机溶剂，有机溶剂去除单元的前端连接检测器；所述的活性评价单元包括混合器、缓冲液储罐和酶电极，混合器与有机溶剂去除单元的后端相连接，缓冲液储罐连接至混合器，混合器连接至酶电极；所述的计算机分别电连接所述的检测器与酶电极。
[0009]作为优选，所述的色谱分离单元采用高效液相色谱分离系统或超高压液相色谱分尚系统。
[0010]作为优选，所述的检测器选用单波长紫外检测器、二极管整列检测器或荧光检测器。
[0011]作为优选，所述的有机溶剂去除单元包括氮气钢瓶、氮气泵、加热管和蒸发管，氮气钢瓶通过氮气泵连接加热管，所述的蒸发管包括上隔层和下隔层，下隔层为流动相管路，流动相管路的前端与检测器相连接，上层为加热氮气管路，加热氮气管路与加热管相连接，上隔层和下隔层之间为微孔渗透膜，流动相管路后端与混合器相连接。
[0012]作为再优选，所述的微孔渗透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纤维膜构成。
[0013]作为再优选，所述的氮气钢瓶采用常规的氮气钢瓶，氮气泵流量控制范围:0.1-2L/h，压力:5-50 PSI，加热管温度控制范围:50-100 °C。
[0014]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种液相色谱-酶电极联用中药成分活性在线分析方法，该方法采用上述的液相色谱-酶电极联用装置进行包括以下步骤的操作:
1)流动相的配制
采用有机溶剂为有机相，以水或缓冲溶液为水相，经微孔滤膜滤过后，备用；
2)待测样品的预处理
取待测样品，经提取、溶剂萃取、浓缩、定容、微孔滤膜滤过等操作过程，制备成供试品溶液，备用；
3)活性评价单元缓冲液的配制 根据需要，选择适宜的缓冲液体系，配制缓冲溶液，备用；
4)色谱分离条件设置
在已连接完整的液相色谱-酶电极联用装置上，开启计算机，设置流动相流速，选择梯度洗脱需要设置梯度洗脱程序；取步骤I)的流动相，开启色谱泵驱动流动相，进入分离程序；
5)进样
取步骤2)的供试品溶液，经进样阀注入色谱分离系统；在步骤4)的分离条件进行成分分离；同时开启检测器电源，设置检测器检测参数；供试品溶液通过色谱分离柱，复杂成分实现柱分离；分离后的成分由检测得到色谱信号，并流出检测器成为分离成分溶液；
6)有机溶剂去除
色谱分离单元开启的同时开启有机溶剂去除单元，将步骤5)的纯化成分溶液中的有机溶剂去除，纯化成分保留在水相中成为纯化成分水溶液；
7)酶电极安装
购买市售小型酶电极，或选择适宜的酶，自行制备固定化酶电极，安装于活性评价单元，备用；
8)活性评价
步骤6)的纯化水溶液流入混合器，同时取步骤2)的缓冲液，注入混合器中混合，混合流经步骤7)的酶电极，成分与酶结合反应，产生电流或电位等信号改变，计算机检测信号得到电化学信号；
9)数据分析
根据步骤5)得到的色谱信号，以及步骤8)得到的电化学信号，通过数据分析，得到待测样品中的成分组成信息，并进一步明确各组分对应的酶结合活性，得到成分-活性在线评价结果。
[0015]作为优选，所述的步骤I)有机溶剂选用甲醇或乙腈。
[0016]本发明由于采用了上述的实验装置及应用步骤，具有以下的特点:
1、设计创新性
现有的分析技术均以化学成分研究为目的，无法提供即时的生物活性信息。本发明专利选择与中药功效相关的酶蛋白分子，制备酶电极，作为活性评价的靶标，能够在线、实时提供分析样品中各成分的生物活性，实现分析待测样品中的成分组成并在线评价各组分对应的生物活性。酶电极联合液相分析，能够突破现有分析技术中成分活性信息的缺失，为建立新的中药质量评价模式提供思路和技术方案。
[0017]2、应用前景及作用良好
该技术能够推广应用至其他中药，能够进一步加强与中医理论相结合的有效成分研究，最终建立一种新的以成分、活性为综合指标的中药质量评价体系，通过加强质控，提高中药材质量，促进中药产业发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1本发明的装置示意图。
[0019]图2成分-活性在线评价模式示意图。[0020]图3白术醇提物HPLC图。
[0021]图4白术成分酶电极检测信号图，a, b, C，d依次为白术内酯I1、111、I和苍术酮。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
如图1所示的一种液相色谱-酶电极联用装置，该装置包括色谱分离单元、检测器、有机溶剂去除单元、活性评价单元和计算机12，色谱分离单元采用高效液相色谱分离系统或超高压液相色谱分离系统，检测器选用单波长紫外检测器、二极管整列检测器或荧光检测器。所述的色谱分离单元包括依次通过管路相互连接的流动相储罐1、色谱泵2、进样阀3和液相色谱柱4，液相色谱柱4通过管路连接所述的检测器5。所述的有机溶剂去除单元包括氮气钢瓶、氮气泵7、加热管8和蒸发管6，氮气钢瓶采用常规的氮气钢瓶，氮气泵7流量控制范围:0.1-2 L/h，压力:5-50 PSI，加热管8温度控制范围:50-100 °C。氮气钢瓶通过氮气泵7连接加热管8，所述的蒸发管6包括上隔层和下隔层，下隔层为流动相管路，流动相管路的前端与检测器5相连接，上层为加热氮气管路，加热氮气管路与加热管8相连接，上隔层和下隔层之间为微孔渗透膜，微孔渗透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纤维膜构成。所述的活性评价单元包括混合器9、缓冲液储罐10和酶电极11，混合器9连接流动相管路的后端相连接，缓冲液储罐10连接至混合器9，混合器9连接至酶电极11 ;所述的计算机12分别电连接所述的检测器5与酶电极11。
[0023]实施例2
一种液相色谱-酶电极联用中药成分活性在线分析方法，该方法采用实施例1的液相色谱-酶电极联用装置进行包括以下步骤的操作:
I)流动相的配制
以水为水相，甲醇为有机相。取去离子纯水和色谱甲醇，分别过0.45μ孔径的微孔滤膜，滤液分别置于水相及有机相溶剂瓶中，备用。
[0024]2)待测样品的预处理
取干燥白术药材，粉碎，称取0.6 g，置于25 mL容量瓶中，加20 mL甲醇，超声提取20min，取出，放至室温，加色谱甲醇至刻度，摇匀，提取液经0.22 μ微孔滤膜滤过，续滤液置于进样瓶中，制备成供试品溶液，备用。
[0025]3)活性评价单元缓冲液的配制
选择PH与人工肠液接近的缓冲液，称取磷酸二氢钾6.8 g，置于1000 mL容量瓶中，力口水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节PH值至6.8，加水至刻度，摇匀，即得缓冲液，备用。
[0026]4)色谱分离条件设置
液相色谱系统选用LC-20A-VP液相色谱仪(日本岛津)，CAPCELL PAK C18分析色谱柱(250 mmX4.6 mm,5 μ m)，连接实验装置各部件；开启计算机电源，设置流动相流速为1.0mL/min，梯度洗脱程序见表；取步骤I)的流动相，将色谱泵水相及有机相泵头置于各自的溶剂瓶中，开启色谱泵电源，以梯度洗脱程序起始比例驱动流动相，系统平衡20 min后运行梯度洗脱程序。
[0027]梯度洗脱程序
【权利要求】
1.一种液相色谱-酶电极联用装置，该装置包括色谱分离单元、检测器、有机溶剂去除单元、活性评价单元和计算机(12)，其特征在于:色谱分离单元包括依次通过管路相互连接的流动相储罐(I)、色谱泵(2)、进样阀(3)和液相色谱柱(4)，液相色谱柱(4)通过管路连接所述的检测器(5);所述的有机溶剂去除单元用于去除样品中的有机溶剂，有机溶剂去除单元的前端连接检测器(5);所述的活性评价单元包括混合器(9)、缓冲液储罐(10)和酶电极(11)，混合器(9)连接与有机溶剂去除单元的后端相连接，缓冲液储罐(10)连接至混合器(9)，混合器(9)连接至酶电极(11);所述的计算机(12)分别电连接所述的检测器(5)与酶电极(11)。
2.根据权利要求1所述的一种液相色谱-酶电极联用装置，其特征在于:所述的色谱分离单元采用高效液相色谱分离系统或超高压液相色谱分离系统。
3.根据权利要求1所述的一种液相色谱-酶电极联用装置，其特征在于:检测器(5)选用单波长紫外检测器(5 )、二极管整列检测器(5 )或荧光检测器(5 )。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种液相色谱-酶电极联用装置，其特征在于:所述的有机溶剂去除单元包括氮气钢瓶、氮气泵(7)、加热管(8)和蒸发管(6)，氮气钢瓶通过氮气泵连接加热管(8)，所述的蒸发管(6)包括上隔层和下隔层，下隔层为流动相管路，流动相管路的前端与检测器(5)相连接，上层为加热氮气管路，加热氮气管路与加热管(8)相连接，上隔层和下隔层之间为微孔渗透膜，流动相管路后端与混合器(9)相连接。
5.根据权利要求4所述的一种液相色谱-酶电极联用装置，其特征在于:微孔渗透膜由多孔聚四氟乙烯膜及中空纤维膜构成。
6.根据权利要求4所述的一种液相色谱-酶电极联用装置，其特征在于:氮气钢瓶采用常规的氮气钢瓶，氮气泵流量控制范围:0.l_2L/h，压力:5-50PSI，加热管(8)温度控制范围:50-100°Co
7.一种液相色谱-酶电极联用中药成分活性在线分析方法，其特征在于:该方法采用权利要求广6任意一项权利要求所述的液相色谱-酶电极联用装置进行包括以下步骤的操作: 1)流动相的配制 采用有机溶剂为有机相，以水或缓冲溶液为水相，经微孔滤膜滤过后，备用； 2)待测样品的预处理 取待测样品，经提取、溶剂萃取、浓缩、定容、微孔滤膜滤过等操作过程，制备成供试品溶液，备用； 3)活性评价单元缓冲液的配制 根据需要，选择适宜的缓冲液体系，配制缓冲溶液，备用； 4)色谱分离条件设置 在已连接完整的液相色谱-酶电极联用装置上，开启计算机，设置流动相流速，选择梯度洗脱需要设置梯度洗脱程序；取步骤I)的流动相，开启色谱泵驱动流动相，进入分离程序； 5)进样 取步骤2)的供试品溶液，经进样阀注入色谱分离系统；在步骤4)的分离条件进行成分分离；同时开启检测器(5)电源，设置检测器(5)检测参数；供试品溶液通过色谱分离柱，复杂成分实现柱分离；分离后的成分由检测得到色谱信号，并流出检测器(5)成为分离成分溶液； 6)有机溶剂去除 色谱分离单元开启的同时开启有机溶剂去除单元，将步骤5)的纯化成分溶液中的有机溶剂去除，纯化成分保留在水相中成为纯化成分水溶液； 7)酶电极(11)安装 购买市售小型酶电极(11)，或选择适宜的酶，自行制备固定化酶电极(11)，安装于活性评价单元，备用； 8)活性评价 步骤6)的纯化水溶液流入混合器(9)，同时取步骤2)的缓冲液，注入混合器(9)中混合，混合流经步骤7)的酶电极(11 )，成分与酶结合反应，产生电流或电位等信号改变，计算机检测信号得到电化学信号； 9)数据分析 根据步骤5)得到的色谱信号，以及步骤8)得到的电化学信号，通过数据分析，得到待测样品中的成分组成信息，并进一步明确各组分对应的酶结合活性，得到成分-活性在线评价结果。
8.根据权利要求7所述的一种液相色谱-酶电极联用中药成分活性在线分析方法，其特征在于:步骤I)有机溶剂选用甲醇或乙腈。
【文档编号】G01N30/88GK104007219SQ201410248217
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】寿旦, 王娜妮, 张扬, 董宇 申请人:浙江省中医药研究院