一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测饲料中微量植酸酶活性的方法。本方法在现有方法的基础上，通过增加称样量和反应体系中的酶液量，能显著提高饲料中植酸酶的检测灵敏度，使线性检测限降低到0.1U/g。当饲料中植酸酶酶活为0.18U/g时，利用本发明所述方法检测的酶活回收率高达98.92％，变异系数仅为0.5％(n＝6)，两次实验的误差小，从而说明本发明提供的方法其准确性和精确度均超过国标GB/T18634-2009《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》的要求，取得意料不到的技术效果。
【专利说明】一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及酶制剂检测【技术领域】，具体涉及一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法。【背景技术】
[0002]植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。
[0003]由于植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钥酸铵生成黄色的复合物，因此，在波长415nm下进行比色，可测定植酸酶活性。目前已形成国标GB/T18634— 2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。
[0004]但是，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题:①由于植酸酶在饲料中的添加量较低，现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来；②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钥酸铵发生显色反应，干扰415nm波长下的比色反应，从而影响酶活测定。
[0005]国标GB/T18634— 2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》用于测定植酸酶样品，相对较为准确，但是，用于测定添加在饲料中的植酸酶，该方法的检测下限为2.0U/g饲料，而实际饲料中的植酸酶酶活约为0.5U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。另外，饲料中无机磷含量远高于反应生成的无机磷量，影响植酸酶与底物的反应。样品空白吸光值超出测定范围。因此，目前急需开发一种准确检测饲料中微量植酸酶含量的方法。
【发明内容】
[0006]本发明为解决现有技术问题提供了一种能够检测饲料中微量植酸酶活性的方法，具体是通过增加称样量和反应体系中的酶液量，有效提高检测的灵敏度。
[0007]本发明所采用的技术方案是:本发明所述测定饲料中微量植酸酶活性的方法，其步骤如下:
[0008](I)试剂和溶液的配制
[0009]本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
[0010](1.1)0.25mol/L 乙酸缓冲液(I ):称取 34.02g 三水乙酸钠(CH3COONa.3Η20)于IOOOml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0 ± 0.0I，并用蒸馏水定容至IOOOml，室
温下存放两个月有效。
[0011](1.2)0.25mol/L 乙酸缓冲液(II ):称取 34.02g 三水乙酸钠(CH3COONa.3H20)，
0.5g Trion X — 100，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于IOOOml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0 ± 0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
[0012](1.3) 7.5mmol/L 植酸钠溶液:称取 0.6929g 肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于 IOOml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(I )溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。[0013](1.4)硝酸溶液:I体积硝酸与2体积水混合均匀。
[0014](1.5) 100g/L 钥酸铵溶液:称取 IOg 钥酸铵[(NH4) 6Μο7024.4H20]于 100mL 容量瓶中，加入1.0ml氨水(25% )用水溶解定容至刻度。
[0015](1.6) 2.35g/L钒酸铵溶液:称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
[0016](1.7)颜色终止液:移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钥酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。
[0017](1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)
[0018](1.9)已知酶活的液体植酸酶
[0019](2)测定
[0020](2.1)标准曲线
[0021]称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为0u、0.5u、lu、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000Xg离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0OOlmg)的超滤管，7000 Xg离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(Iml缓冲液=1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
[0022]取IOml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37°C水浴30min。
[0023]反应步骤及试剂、溶液用量见表1。
[0024]表1反应步骤及试剂、溶液用量
[0025]
【权利要求】
1.一种微量植酸酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)试剂 本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。消洗实验用容器不要用含磷消洗剂。 (1.1)0.25mol/L 乙酸缓冲液(I):称取 34.02g 三水乙酸钠(CH3COONa.3H20)于 1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。 (1.2)0.25mol/L 乙酸缓冲液(II):称取 34.02g 三水乙酸钠.(CH3COONa.3H20)，.0.5gTrionx-100，0.5g牛血消白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0 ± 0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。 (1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液:称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(I)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。 (1.4)硝酸溶液:1体积硝酸与2体积水混合均匀。 (1.5) 100g/L钥酸铵溶液:称取IOg钥酸铵[(NH4) 6Μο7024.4H20]于100mL容量瓶中，加入1.0ml氨水(25% )用水溶解定容至刻度。 (1.6)2.35g/L钒酸铵溶液:称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于.100mL棕色容量瓶中，加入.2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。 (1.7)颜色终止液:移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钥酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。 (1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型) (1.9)已知酶活的液体植酸酶 ⑵测定 (2.1)标准曲线 称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为0u、0.5u、lu、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取.30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000 Xg离心10min。取上消液过0.45um滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至.0.0OOlmg)的超滤管，7000 Xg离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2),通过称重(Iml缓冲液=1.00263g)定溶至4ml,混合均匀，制成待反应样液。 取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37°C水浴30min。 反应步骤及试剂、溶液用量见下表。__
【文档编号】G01N21/78GK104007110SQ201410251271
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】王海, 马向东, 周茜, 邵静 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司