基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，涉及蛋白质检测领域。基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法包括以下步骤：分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、C2，判定C2大于等于1.6C1，确定待检测奶牛已经妊娠。BRCA2蛋白的用途，用于诊断奶牛是否妊娠。本发明能够在奶牛人工授精后18天进行妊娠诊断，只需要采集少量的奶牛血液就可以进行诊断，能够减少对奶牛生殖系统的损伤，节约劳动力，能够有效降低饲养管理的成本，提高奶牛场的经济效益。
【专利说明】基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质检测领域，具体涉及一种基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否 妊娠的方法及用途。
【背景技术】
[0002] 快速诊断奶牛是否妊娠是改善牛场饲养管理、提高奶牛繁殖率的有效途径。现有 的奶牛妊娠诊断方法包括直肠触诊法、直肠超声波法、孕酮测定诊断法、妊娠相关蛋白测定 法和乳胶凝集实验法。
[0003] 现有的奶牛妊娠诊断方法存在以下缺陷：
[0004] (1)直肠触诊法是通过实践经验丰富的工作人员触摸奶牛直肠、检测奶牛的胚胎， 能够判断妊娠时间为40?50天的奶牛是否妊娠，直肠超声波法是通过专职技术人员操作 B超仪，对待检测奶牛进行检测，能够判断妊娠时间为27天的奶牛是否妊娠。
[0005] 直肠触诊法和直肠超声波法的劳动强度较大，不仅工作效率较低，而且难以在奶 牛妊娠早期进行诊断，容易造成奶牛的产犊间隔延长、繁殖率降低、产奶量减少，增加了饲 养管理的成本，降低了奶牛养殖的经济效益。
[0006] 采用直肠触诊法进行诊断时，容易触及子宫和胎膜，对早期胚胎造成伤害，甚至导 致母牛直肠组织破坏。
[0007] (2)孕酮测定诊断法是通过采集配种21?24天后的奶牛的奶样，通过测定奶样中 孕酮的含量判断对应的奶牛是否妊娠。
[0008] 孕酮测定诊断法包括放射免疫测定法和酶免疫测定法，放射免疫法的标记物具有 放射性，检测设备价格较高，检测周期较长；酶免疫测定法时，存在假阳性问题，难以判断奶 牛是否妊娠。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于BRCA2蛋白、mRNA 诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够降低劳动强度强度，提高工作效率，能够在奶牛妊娠 早期进行诊断，不仅成本较低，而且比较准确。
[0010] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否 妊娠的方法，包括以下步骤：
[0011] 分别采集待检测奶牛人工授精〇天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授 精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的 含量C2,判定C2大于等于1.6C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。
[0012] 在上述方案的基础上，所述测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含 量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2之后，还包括以下步骤：判定 C2小于1. 6C1时，重复执行所有步骤。
[0013] 在上述方案的基础上，采用蛋白质印迹法测定奶牛人工授精0天的血液样本中 BRCA2蛋白的含量Cl、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2。
[0014] 一种BRCA2蛋白的用途，用于诊断奶牛是否妊娠：分别采集待检测奶牛人工授精0 天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、 奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2,判定C2大于等于1. 6C1时，确定待 检测奶牛已经妊娠。
[0015] 一种基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步骤：采集 待检测奶牛人工授精〇天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天 的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对 表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2,判定D2大于等于2D1 时，确定待检测奶牛已经妊娠。
[0016] 在上述方案的基础上，所述分别检测第二血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相 对表达量D1、第一血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2之后，还包括以下步 骤：判定D2小于2D1时，重复执行所有步骤。
[0017] 在上述方案的基础上，所述提取第一血液样本中的RNA并反转录成cDNA包括以下 步骤：提取第一血液样本中的RNA，将第一血液样本中的RNA反转录成对应的cDNA。
[0018] 在上述方案的基础上，所述提取第二血液样本中的RNA并反转录成cDNA包括以下 步骤：提取第二血液样本中的RNA，将第二血液样本中的RNA反转录成对应的cDNA。
[0019] 一种BRCA2蛋白对应的mRNA的用途，用于诊断奶牛是否妊娠：采集待检测奶牛人 工授精〇天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的血液样本，作 为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D1、第二 血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2,判定D2大于等于2D1时，确定待检测 奶牛已经妊娠。
[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0021] (1)本发明提供的基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够在 人工授精后18天，通过检测奶牛血液样本中的BRCA2蛋白、mRNA的相对表达量，诊断该奶 牛是否妊娠，与现有的直肠触诊法相比，不仅能够减少对奶牛生殖系统的损伤，而且能够在 奶牛妊娠早期进行诊断，有效降低饲养管理的成本，提高奶牛养殖的经济效益。
[0022] (2)本发明提供的基于BRCA2蛋白、mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够通 过测定奶牛血液样本中的BRCA2蛋白和mRNA的相对表达量，判断待测奶牛妊娠18天BRCA2 蛋白的含量是否高于奶牛人工授精后〇天BRCA2蛋白的含量的1. 6倍以上；或者判断奶牛 妊娠18天后BRCA2蛋白对应的mRNA的表达量，是否高于2倍的奶牛人工授精0天BRCA2 蛋白对应的mRNA的表达量。与现在生产中常见的妊娠诊断技术相比，不仅操作比较简单， 而且准确度较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明中不同妊娠时间下奶牛血清中BRCA2蛋白的含量示意图；
[0024] 图2为本发明实施例中不同妊娠时间下奶牛的血清中BRCA2蛋白对应的mRNA在 妊娠牛外周血中的表达规律示意图；
[0025] 图3为本发明实施例中通过灰度法检测奶牛血清中BRCA2蛋白的表达结果示意 图。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
[0027] 本发明实施例提供一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步 骤：
[0028] 分别采集待检测奶牛人工授精后0天、18天的尾静脉血，在转速为5000r/min的 条件下离心15min，得到对应的血清样本，将血清样本放置于体积为1. 5ml的离心管中，将0 天对应的血清样本记录为第一样本，将18天对应的血清样本记录为第二样本，将第一样本 和第二样本放置于温度为-20°C的条件下保存；
[0029] 采用western blot技术（蛋白质印迹法）检测第一样本中BRCA2蛋白的含量C1, 检测第二样本中BRCA2蛋白的含量C2,判断C2是否大于等于1. 6C1，若是，确定待检测奶牛 已经妊娠；若否，采集下一头待检测奶牛的血液样本,重复执行所有步骤。
[0030] 本发明实施例还提供一种基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法， 包括以下步骤：
[0031] 采集待检测奶牛人工授精后0天的尾静脉血作为第一血液样本、采集待检测奶牛 人工授精后18天的尾静脉血作为第二血液样本，将第一血液样本、第二血液样本放置于 EDTA抗凝管中；
[0032] 采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep pure (RNA预纯化）血液总 RNA提取试剂盒分别提取第一血液样本、第二血液样本中的RNA，分别取500ngRNA，使用 RevertAid TM First-Strand cDNA Synthesis kit反转录成对应的cDNA，将第一血液样本 对应的cDNA作为第一 cDNA，将第二血液样本对应的cDNA作为第二cDNA ;
[0033] 利用定量PCR分别检测第一 cDNA、第二cDNA中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表 达量：判断第一 cDNA中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量是否大于等于第二cDNA中 BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量的2倍，若是，确定待检测奶牛已经妊娠；若否，采集 下一头待检测奶牛的血液样本，重复执行所有步骤。
[0034] 下面对上述2种方法的可靠性进行验证。
[0035] S1 :采集样本
[0036] S101 :对若干头奶牛进行人工授精，采集每头奶牛人工授精0天、14天、18天、21 天、28天后的血样，每次采集血样后，均将血样在转速为5000r/min的条件下离心15min，分 离离心后的血样，得到血清。将血清收集到1. 5ml离心管中并标记，放置于-20°C的条件下 保存。
[0037] S102 :采用直肠检测法判断人工授精60天的奶牛是否已经妊娠，若是，采集9头妊 娠奶牛的血清作为妊娠奶牛血清；若否，采集12头未妊娠奶牛的血清作为空怀奶牛血清。
[0038] S103 :等量量取9头妊娠奶牛人工授精14天的血清样本，并混合均匀，得到第一待 测样本A1 ;等量量取9头妊娠奶牛人工授精18天的血清样本，并混合均匀，得到第二待测 样本A2 ;等量量取9头妊娠奶牛人工授精21天的血清样本，并混合均匀，得到第三待测样 本A3 ;等量量取9头妊娠奶牛人工授精28天的血清样本，并混合均匀，得到第四待测样本 A4。
[0039] S104 :等量量取12头空怀奶牛人工授精14天的血清样本，并混合均勻，得到第一 对比样本B1 ;等量量取12头空怀奶牛人工授精18天的血清样本，并混合均匀，得到第二对 比样本B2 ;等量量取12头空怀奶牛人工授精21天的血清样本，并混合均匀，得到第三对比 样本B3 ;等量量取12头空怀奶牛人工授精28天的血清样本，并混合均匀，得到第四对比样 本B4。
[0040] S105 :等量量取9头妊娠奶牛、12头空怀奶牛人工授精0天的血清样本，并混合均 勻，得到第一空白样本AB1。
[0041] S2 :去除所有血清样本中的高丰度蛋白，对所有血清样本的体积进行定量。
[0042] 分别量取20 μ 1第一待测样本Α1、20 μ 1第二待测样本Α2、20 μ 1第三待测样本 Α3、20 μ 1第四待测样本Α4、20 μ 1第一对比样本Β1、20 μ 1第二对比样本Β2、20 μ 1第三对 比样本Β3、20μ 1第四对比样本Μ和20μ 1第一空白样本ΑΒ1。
[0043] 向上述所有样本中分别加入450 μ 1 Binding Buffer (结合缓冲）溶液并混合均 匀，得到对应的样本稀释液。
[0044] 将850 μ 1 Binding Buffer溶液加入去血清高丰度蛋白柱后，将所有的样本混合 液依次加入去血清高丰度蛋白柱，并收集对应的穿流液，得到对应的样本穿流液。
[0045] 分别将所有的样本穿流液放入型号为10kD (蛋白质分子量单位）的超滤离心管 中离心至100 μ 1，得到对应的样本浓缩液，采用由Bradford(美国伯乐）生产的bio-Rad protein assay kit(蛋白质含量测定）试剂盒测定每个样本浓缩液的浓度。
[0046] S3 :对每个所有样本进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶）电泳
[0047] 分别取20 μ g所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液中加入4μ g上样缓冲 液，置于沸水中保温5min后，在离心力为14000g(g为离心力单位）的条件下离心20min， 取上清液，将上清液加入浓度为12. 5 %的SDS-PAGE中，在横流电流为14mA的条件下电泳 90min后，使用考马斯亮蓝（一种染料名称）进行染色，得到所有样本的样本浓缩液的电泳 图谱。
[0048] S4 :酶解、肽段定量和肽段标记
[0049] 分别取200 μ g所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液中加入30 μ 1 SDT溶 液，SDT溶液由4% SDS (十二烷基硫酸钠）、100mMTris-HCl (三羟甲基氨基甲烷）、100mM DTT (二硫苏糖醇）混合后调节pH至7. 6而制成，并混合均匀，置于沸水中保温5min后，冷却 至室温并加入200μ1 UA buffer(尿素缓冲溶液）（尿素缓冲溶液由浓度为8M的Urea和浓 度为150mM、pH为8. 0的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液配置而成）混合均勻，放入型号为30kD 的超滤离心管中，在离心力为14000g的条件下离心30min，去除滤液后，加入100μ 1浓度 为50mM的ΙΑΑ (Indol-yl-3-Acetic Acid，吲哚乙酸）溶液，在转速为600rpm的条件下震荡 lmin，并于室温下避光放置30min后，在离心力为14000g的条件下离心20min，加入100 μ 1 UA buffer(sodium hypochlorite buffer,次氯酸钠缓冲溶液），在离心力为14000g的条 件下离心20min后，再次加入100μ 1 UA buffer,在离心力为14000g的条件下离心20min 后，加入40μ 1 Trypsin buffer(胰酶缓冲溶液，由2μ g的胰酶溶解于40μ 1的分散液中制 成），在震荡速度为600rpm的条件下振荡lmin后，在温度为37°C的条件下静置16?18h， 在离心力为14000g的条件下离心10min后，得到滤液，滤液为0D280肽段溶液。
[0050] 定量分析所有0D280肽段溶液，测定所有0D280肽段溶液中0D280肽段的浓度。
[0051] 分别取100 μ g所有的0D280肽段溶液，分别加入由ABI公司生产的型号为iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的试剂盒（一种用于对肽段进行同位素相对标记与绝对定 量的试剂盒）进行标记。iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的试剂盒中的iTRAQ试剂 包括肽反应标记试剂基团、8个报告基团和8个质量平衡基团。
[0052] 8个报告基团的相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121，与上 述报告基团对应的8个平衡基团的相对分子质量分别为32、31、30、29、28、27、26和24，所有 0D280肽段溶液中的多肽通过iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的试剂盒（下文中简 称为试剂盒Kit)标记后均能形成8种相对分子质量为145的等量异位标签。
[0053] 参见表1、表2所示，第一空白样本AB1对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相 对分子量为113的报告基团标记。
[0054] 第一待测样本A1对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子量分别为114、 118的报告基团标记；第二待测样本A2对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子 量分别为115U19的报告基团标记；第三待测样本A3对应的0D280肽段溶液被iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit的试剂盒中相对分子量分别为116、118的报告基团标记； 第四待测样本A4对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子量分别为117、119的报 告基团标记。
[0055] 第二待测样本A2对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子量分别为115、 119的报告基团标记；第一对比样本B1对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子量 为114的报告基团标记；第二空白样本B2对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分子 量为115的报告基团标记；第三对比样本B3对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对分 子量为116的报告基团标记；第四对比样本Μ对应的0D280肽段溶液被试剂盒Kit中相对 分子量为117的报告基团标记。
[0056] 表1、第一样本标记
[0057]
【权利要求】
1. 一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，包括以下步骤： 分别采集待检测奶牛人工授精〇天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0 天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量 C2,判定C2大于等于1. 6C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。
2. 如权利要求1所述的基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于：所述 测定奶牛人工授精〇天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本 中BRCA2蛋白的含量C2之后，还包括以下步骤：判定C2小于1. 6C1时，重复执行所有步骤。
3. 如权利要求1或2所述的基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于： 采用蛋白质印迹法测定奶牛人工授精〇天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授 精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2。
4. 一种BRCA2蛋白的用途，其特征在于：用于诊断奶牛是否妊娠：分别采集待检测奶 牛人工授精〇天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2 蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2,判定C2大于等于 1. 6C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。
5. -种基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 采集待检测奶牛人工授精〇天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工 授精18天的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的 mRNA的相对表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2,判定D2 大于等于2D1时，确定待检测奶牛已经妊娠。
6. 如权利要求5所述的基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征 在于：所述分别检测第二血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D1、第一血液样 本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2之后，还包括以下步骤：判定D2小于2D1时， 重复执行所有步骤。
7. 如权利要求5或6所述的基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其 特征在于，所述提取第一血液样本中的RNA并反转录成cDNA包括以下步骤：提取第一血液 样本中的RNA，将第一血液样本中的RNA反转录成对应的cDNA。
8. 如权利要求7所述的基于BRCA2蛋白对应的mRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征 在于，所述提取第二血液样本中的RNA并反转录成cDNA包括以下步骤：提取第二血液样本 中的RNA，将第二血液样本中的RNA反转录成对应的cDNA。
9. 一种BRCA2蛋白对应的mRNA的用途，其特征在于：用于诊断奶牛是否妊娠：采集待 检测奶牛人工授精〇天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的 血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表 达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的mRNA的相对表达量D2,判定D2大于等于2D1 时，确定待检测奶牛已经妊娠。
【文档编号】G01N33/68GK104111339SQ201410294733
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】程蕾, 王定发, 刘晓华, 向敏, 凌明湖, 胡修忠, 夏瑜 申请人:武汉市畜牧兽医科学研究所