一种测定血浆中5’-甲氧基-3’, 4’-亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定血浆中5’-甲氧基-3’,4’-亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒进行萃取，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中5’-甲氧基-3’,4’-亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺的浓度。
【专利说明】—种测定血浆中5’ -甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物分析【技术领域】，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及测定血浆中5’ -甲氧基_3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法。
【背景技术】
[0002]大叶筠(Piper Laetispicum C.DC.)为胡椒科胡椒属植物，主要产于海南、广东、广西、云南等地，民间用于活血、消肿、止痛，主治跌打损伤、瘀血肿痛。近期研究发现大叶筠具有较强的抗抑郁作用，其活性和一系列酰胺类化合物有关。其中5’-甲氧基_3’，4’_亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺(C15H19N04) (K6)为其中含量最高的生物碱。
[0003]目前关于人体服用大叶筠有效部位提取物后血浆中K6的测定方法没有文献报道。本发明建立了大叶筠有效部位提取物中主要有效成分K6在人体内的测定方法，通过该方法对K6在人体内的药物代谢情况进行探索性研究，以期服务于新药开发。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种测定血浆中5’ -甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0006]一种测定血浆中5’ -甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺(K6)浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤:
[0007](I)血浆样品预处理:取血浆样品，加入内标替硝唑溶液，加入乙酸乙酯萃取，吸取上层有机相，40 V下减压浓缩挥干，加入80v/v %甲醇水溶液溶解，离心后取上清液；
[0008](2)将步骤(I)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离:色谱柱为Agilent ZOBAXSB C18，4.6X150mm，5ym ;流动相:体积比为80:20的甲醇与0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液；流速:400mL.mirT1 ;柱温:35°C ;进样量:5 μ L ;洗脱方式为等度洗脱；
[0009](3)质谱测定:条件为:离子源:电喷雾离子化电离源ESI ;离子检测方式:多反应监测(MRM);离子极性:正离子；离子源电压IS:5000V ;离子源温度TEM:400°C ；碰撞气CAD:10L.mirT1 ;气帘气 CUR:20L.mirT1 ;离子源 Gasl:60L.mirT1 ;离子源 Gas2:70L.mirT1 ；检测对象的离子选择通道:5’ -甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺，[M+H]+，m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;内标替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ；
[0010](4)计算:采用内标法，以5’ -甲氧基_3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算5’ -甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度。
[0011]步骤(I)中，于10.0mL玻璃试管中精密加入血浆样品0.5mL，精密加入内标105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L，旋涡10s，加入4.0mL乙酸乙酯，旋涡振荡3min，3000r.mirT1离心1min,吸取上层有机相4mL, 40°C下减压浓缩挥干,加入10 μ L80v/v%甲醇水溶液复溶，旋润lmin, 12000r.mirT1离心5min,吸取上清液。
[0012]其中，所述的血浆为口服大叶筠有效部位提取物后的血浆。本发明对大叶筠有效部位提取物如何制备没有具体限定，现有的制备方法都可以采用。本发明方法重点是保护口服大叶筠有效部位提取物后，血浆内K6的检测方法，从而为研究K6的体内代谢奠定基础。
[0013]其中，所述血浆为人或动物的血浆。
[0014]有益效果:本发明方法与现有技术相比，具有如下优势:
[0015](I)预处理方法简便:有机溶媒液液萃取法，适用于常规测定。
[0016](2)专属性强:采用ZOBAX SB C18色谱柱作为固定相，甲醇和水(0.2mmol -T1醋酸胺)的混合液作为流动相，等度洗脱，K6保留时间为5.3min左右，内标替硝唑保留时间为3.7min左右，6.5分钟完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。
[0017](3)灵敏度高:血浆最低定量限为0.1006ng.mL—1。
[0018](4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为K6的临床血药物浓度测定提供依据，服务于新药研究开发及临床应用。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.1006?25.75ng.ml/1,日内和日间精密度RSD均小于10%。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为质谱图。
[0020]其中，A为人空白血浆的质谱图。B为甲醇加入标准品的质谱图。C人空白血浆加入标准品后的质谱图。D为人空腹服用大叶筠有效部位提取物(含K620.8mg)3h后血浆样品的质谱图。
[0021]注:图中离子选择通道I为K6，[M+H]+，m/z278.1/205.1 ;保留时间为5.3min左右；离子选择通道2为内标替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0，保留时间为3.7min左右。
【具体实施方式】
[0022]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0023]实施例1:人血浆中K6浓度的测定。
[0024]一、实验材料与仪器
[0025]K6对照品:由苏州颐华生物医药技术有限公司提供，批号:20131121 ;替硝唑对照品:由中国药品生物制品检定所提供，批号:100336-200402 ;试验用水:超纯水；甲醇:色谱纯(Merck Company)。
[0026]API4000LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司)，色谱工作站=Analystl.4.2 ；梅特勒MT-5电子天平(瑞士梅特勒公司)；LEGEND MICR017R冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；80-2离心机(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)Millipore Drict_Q5超纯水机(法国 Millipore 公司)。离心浓缩仪:Labconco CentriVap Console (美国 Labconco 公司)
[0027]二、液质条件
[0028]1.液相色谱条件
[0029]色谱柱:AgilentZOBAX SB C18 (4.6 X 150mm, 5 μ m);流动相:甲醇一水(即0.2mmol/L 醋酸胺水溶液)(80:20，v/v);流速:400 μ L.mirT1 ;柱温:35°C。
[0030]2.质谱条件
[0031]离子源:离子源:电喷雾离子化电离源ESI ;离子检测方式:多反应监测(MRM);离子极性:正离子；离子源电压is:5000V ;离子源温度TEM:400°C;碰撞气CAD:10L.mirT1 ;气帘气CUR:20L.min- 1 ;离子源Gasl:60L.min 1 ;离子源Gas2:70L.min-1、检测对象的离子选择通道:K6，[M+H]+, m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;内标替硝唑，[M+H]+,m/z248.1/128.0，DP100, EP10, CE30, CXP8。
[0032]三、实验过程:
[0033]1.Κ6标准溶液的配制:
[0034]精密称取Κ6对照品10.30mg，置于1mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1030 μ g -mL-1K6储备液，再以甲醇依次稀释，配成浓度分别为5.029，10.06，20.12，40.23,80.47，160.9,321.9,643.8，1288ng.mL_1 的 K6 标准溶液。
[0035]2.人血浆样品的处理:
[0036]6名男性空腹服用大叶筠有效部位提取物(含K620.8mg)，用250mL温开水送服；于给药后3h采集外周静脉血4ml,注入肝素管内，避光,离心(3000r *min_1, 1min),分取血浆0.5mL于10.0mL玻璃试管中，精密加入内标替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L，旋涡10s，加入4.0mL乙酸乙酯,旋润振荡3min,3000r.mirT1离心1min,吸取上层有机相4mL,40°C下减压浓缩挥干，加入100 μ L80%甲醇溶液复溶，旋涡lmin，12000r.mirT1离心5min，吸取上清液5 μ L进样(见图1中D)，计算K6和内标峰面积的比值fl，代入标准曲线计算浓度。
[0037]3.专属性:
[0038]取没有给予过大叶筠有效部位提取物的人空白血浆0.5mL于10.0mL玻璃试管中，加入4.0mL乙酸乙酯,旋润振荡3min,3000r.mirT1离心1min,吸取上层有机相4mL,40°C下减压浓缩挥干，加入100 μ L80%甲醇溶液复溶，旋涡lmin，12000r.mirT1离心5min，吸取上清液5μ L进样(见图1中Α)。
[0039]取1.0mL塑料离心管精密加入Κ6标准溶液(160.9ng.mL—1) 10 μ L，加入内标替硝唑溶液(105.6ng.mL-1) 20 μ L, 80 % 甲醇 70 μ L,旋润 lmin,于 12000r.mirT1 离心 5min,吸取上清液5 μ L进样(见图1中B)。
[0040]取没有给予过大叶筠有效部位提取物的人空白血浆0.5mL于10.0mL玻璃试管中，精密加入K6标准溶液(103.0ng.mL—1) 10 μ L，内标替硝唑溶液(105.6ng.mL—1) 20 μ L，旋涡10s,加入4.0mL乙酸乙酯,旋润振荡3min,3000r *min-l离心1min,吸取上层有机相4mL,40°C下减压浓缩挥干，加入100 μ L80%甲醇溶液复溶，旋涡lmin，12000r.mirT1离心5min，吸取上清液5 μ L进样(见图1中C)。
[0041]结果显示，在本实验所采用的LC-MS-MS条件下，血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰，Κ6保留时间在5.3min左右，内标替硝唑保留时间在3.7min左右。K6和内标互不干扰，峰形良好，基线平稳。
[0042] 4.线性试验
[0043]人血浆标准曲线:取10.0mL玻璃试管数支，分别加入没有给予过大叶筠有效部位提取物的空白血浆0.5mL,再分别精密加入不同浓度的K6标准液10 μ L，旋涡1s混匀，配成含 Κ6 的浓度分别为 0.1006，0.2012,0.4023,0.8047、1.609,3.219,6.438、12.88、25.75ng ?ιn-1的含药血浆，按“血浆样品处理”项下操作。计算Κ6峰面积As和内标峰面积Ai的比值f (f = As/Ai)，以峰面积比值f对血药浓度C作回归计算。以平均比值f对血药浓度C作回归计算，得回归方程:f = 0.137XC+0.00898 (r = 0.9990，权重系数w = 1/C*C)，K6血浆浓度在0.1006~25.75ng -ml-1范围内线性关系良好。最低定量限为0.1006ng.mL'
[0044]5.准确度和精密度
[0045]按照人血浆标准曲线方法配制含K6浓度为0.2060,2.060,20.60ng.mL—1的低、中、高的血浆样品，按“人血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天，每天每个浓度各做5份样品，计算K6峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的血浆标准曲线中求得K6实测浓度，由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD)，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示，日内和日间精密度RSD均小于10%，准确度符合要求。
[0046]6.测定结果
[0047]上述给予过大叶筠有效部位提取物的6名男性血浆中K6含量分别为4.969、
5.2636、9.008、5.006、1.295、4.254ng.mL、
[0048]实施例2:人血浆中K6浓度的测定
[0049]参照实施例1，6名女性空腹服用大叶筠有效部位提取物(含K620.8mg)，用250mL温开水送服；于给药后3h 采集外周静脉血4mL，注入肝素管内，避光，离心(3000r.mirT1，1min)制备血浆。含药血浆样品处理及测定条件相同，结果给予过大叶筠有效部位提取物的 6 名女性血浆中 K6 含量分别为 9.323、12.54、12.55、13.09,5.011,7.569ng.mL'
【权利要求】
1.一种测定血浆中5’-甲氧基_3’，4’-亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤: (1)血浆样品预处理:取血浆样品，加入内标替硝唑溶液，加入乙酸乙酯萃取，吸取上层有机相，40°C下减压浓缩挥干，加入80v/v%甲醇水溶液溶解，离心后取上清液； (2)将步骤(I)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离:色谱柱为AgilentZOBAX SBα8，4.6Χ150πιπι，5μπι;流动相:体积比为80:20的甲醇与0.2mmol.L-1醋酸胺水溶液；流速:400mL.miiT1 ;柱温:35°C ;进样量:5 μ L ;洗脱方式为等度洗脱； (3)质谱测定:条件为:离子源:电喷雾离子化电离源ESI;离子检测方式:多反应监测；离子极性:正离子；离子源电压IS:5000V ;离子源温度TEM:400 0C ;碰撞气CAD:1L.mirf1 ;气帘气 CUR:20L.mirf1 ;离子源 Gasl:60L.mirf1 ;离子源 Gas2:70L.mirf1 ;检测对象的离子选择通道:5’ -甲氧基_3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺，[M+H]+，m/z278.1/205.1，DP140, EP10, CE21, CXP9 ;内标替硝唑，[M+H]+，m/z248.1/128.0, DP100,EP10, CE30, CXP8 ； (4)计算:采用内标法，以5’-甲氧基_3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算5’ -甲氧基_3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中5’-甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法，其特征在于，步骤(I)中，于10.0mL玻璃试管中精密加入血浆样品0.5mL,精密加入内标105.6ng.mL—1替硝唑溶液20 μ L，旋涡1s,加入4.0mL乙酸乙酯，旋润振荡3min,3000r.mirT1离心1min,吸取上层有机相4mL, 4(TC下减压浓缩挥干,加入100 μ L80v/v%甲醇水溶液复溶，旋涡lmin，12000r.mirT1离心5min，吸取上清液。
3.根据权利要求1所述的测定血浆中5’-甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法，其特征在于，所述的血浆为口服大叶筠有效部位提取物后的血浆。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中5’-甲氧基-3’，4’ -亚甲二氧苯基桂皮酸异丁基酰胺浓度的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。
【文档编号】G01N30/88GK104076116SQ201410303081
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】张军, 储继红, 李长印, 居文政, 吴婷, 许美娟, 刘史佳 申请人:江苏省中医院