一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医学检测【技术领域】，公开了一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法操作简单，无需预稀释试剂及样本，工作试剂无需配制可直接在各种自动生化分析仪上使用，定量测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液测定基本不受尿液氨基酸及氨的影响。实验表明，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。
【专利说明】一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检验测定【技术领域】，具体的说是涉及一种检测丙氨酰氨基肽酶的 方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 丙氨酰氨基肽酶，简称APP，是亮氨酸氨基肽酶（LAP)的同工酶。血清、尿中丙氨酰 氨基肽酶活性变化与机体某些病理状态密切相关。一些研究表明血清AAP测定可用于肝胆 疾病、肝肿瘤和脂肪肝的诊断。肝内胆汁郁积、重症肝炎、梗阻性黄疸、原发和继发性肝癌均 会造成血清AAP明显增高，其较其他指标敏感。另外一些研究表明尿AAP的测定可应用于 肾小球肾炎、肾小管早期损伤的诊断。在肾移植排异反应、长期服用肾毒性药物治疗对肾小 管的损伤、糖尿病肾病等疾病中，尿AAP均会呈不同程度增高，尤其是在对肾移植排异反应 时尿AAP的检测较N-乙酰-β -D-葡萄糖苷酶（NAG)敏感。因此丙氨酰氨基肽酶的测定对 疾病的鉴别诊断具有重要意义。
[0003]目前，丙氨酰氨基肽酶的测定方法主要是酶联免疫吸附测定法。酶联免疫吸附测 定法的测定丙氨酰氨基肽酶原理的为双抗体夹心ELISA法，该方法在测定时需要事先对标 准品进行预稀释（倍比稀释），工作试剂在使用前也需要预稀释并按比例配制，操作过程十 分复杂，测定结果极易受人为因素影响，从而影响测定结果的准确性。且该方法的不同检测 试剂需要在不同条件下保存，并且检测试剂的有效期短，故不能被广泛应用。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明目的是针对现检测丙氨酰氨基肽酶的方法准确性差等问题，提 供了一种准确度高的检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0的缓冲液中，待测样品与L-丙 氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变 化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
[0007] 作为优选，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
[0008] 为优选，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
[0009] 本发明还提供了一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括L-丙氨酰对硝基苯胺、 PH7. 5?8. 0的缓冲液和激活剂。
[0010] 作为优选，所述L-丙氨酰对硝基苯胺浓度为8?12mmol/L。
[0011] 作为优选，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
[0012] 作为优选，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
[0013] 作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒还包括稳定剂。
[0014] 作为优选，所述稳定剂为叠氮钠。
[0015] 作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒包括80mmol/L?120mmol/ L pH7. 5 ?8. OTris-HCL 缓冲液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L_ 丙氛酸对硝基苯胺、0. lmmol/L ? 0. 3mmol/L 叠氣纳、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6mmol/L 硫酸锋。
[0016] 与现有技术相比，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法操作简单，无需预稀释 试剂及样本，工作试剂无需配制可直接在各种自动分析仪上使用，定量测定人血清或尿液 中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液测定基本不受尿液氨基酸及氨的影响。实验表明，本发明所 述检测丙氨酰氨基肽酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发 明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检 测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单 位测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。
【具体实施方式】
[0017] 本发明实施例公开了一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0018] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0019] 一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0的缓冲液中，待测样品与L-丙 氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变 化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
[0020] 本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7. 5?8. 0缓冲液中，底物L-丙 氨酰对硝基苯胺在待检样品中的丙氨酰氨基肽酶作用下分解出对硝基苯胺，然后通过在 405nm波长下检测每分钟对硝基苯胺吸光度的变化率（Λ Α/分钟），计算AAP的活性。
[0021] 待测样品中丙氨酰氨基肽酶的活性按如下公式计算：
[0022] 丙氨酰氨基肽酶含量（U/L) =ΔΑ/分钟X理论因数Κ，
[0023] 其中，上式中Λ Α/分钟通过仪器测定的，为待测样品每分钟吸光度的变化率；理 论因数K为已知的，计算公式为:理论因数(K) = 103XVT// (9. 9XVsXb) = 2525(103 ：mmol 转化umol的因数；VT :反应液总体积；9. 9 :对硝基苯胺在405nm处的毫摩尔消光系数；VS ： 样品体积；b :比色杯光径（cm))。
[0024] 其中，本发明所述检测方法中，所述待测样品可以为人血清或尿液。且所述尿液无 需预处理。
[0025] 根据酶催化反应最适条件的要求，在酶测定体系中还需要加入一定量的激活剂。 激活剂可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。其中，所述激活剂可以为 二价金属离子，如 Mg2.、Zn2.、Mn2.、Ca2+、Fe 2.等。
[0026] 作为优选，本发明所述检测方法中所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌，以提供 Mg2+、Zn2+。在一些实施例中，所述氯化镁为MgCl2 · 6H20，所述硫酸锌为ZnS04 · 7H20。
[0027] 为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。缓冲液 的离子强度也影响着酶的活性，离子强度过高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下 降，但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子 强度。作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法中所述缓冲液为PH7. 5?8. 0的 Tris-HCL 液。
[0028] 进一步的，为了保证待测样品中丙氨酰氨基肽酶充分反应，本发明所述检测丙氨 酰氨基肽酶的方法中所述L-丙氨酰对硝基苯胺、激活剂均过量。
[0029] 本发明还提供了一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括L-丙氨酰对硝基苯胺 溶液、pH7. 5?8. 0的缓冲液和激活剂。
[0030] 其中，作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述L-丙氨酰对 硝基苯胺浓度为8?12mmol/L。更优选为10mmol/L。
[0031] 作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述缓冲液为Tris-HCL 缓冲液。
[0032] 进一步的，作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述缓冲液的 浓度为 80mmol/L ?120mmol/L。
[0033] 作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述激活剂为氯化镁和/ 或硫酸锌。
[0034] 在一些实施例中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述激活剂为氯 化镁和硫酸锌，其中所述氯化镁的浓度优选为0. 5?0. 8mmol/L，更优选为0. 65mmol/L ;所 述硫酸锌的浓度优选为0. 2?0. 6mmol/L,更优选为0. 5mmol/L。
[0035] 进一步的，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒还包括稳定剂。
[0036] 作为优选，所述稳定剂为叠氮钠。进一步的，所述叠氮钠工作浓度为0. lmmol/L? 0. 3mmol/L,更优选为 0. 2mmol/L。
[0037] 在一些具体实施方案中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒包括80mmol/ L ?1 20mmo1 /Τ, pH7. 5 ?8. OTris-HCL 缓冲液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L-丙氛酸对硝基苯胺、 0. lmmol/L ?0. 3mmol/L 叠氣纳、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6mmo 1 / L硫酸锌。
[0038] 进一步的，在一些实施例中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒由 100mmol/LpH7. 5 ?8. OTris-HCL 缓冲液、10mmol/L L-丙氛酸对硝基苯胺、0. 2mmol/L 叠氣 钠、0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸锌组成。
[0039] 本发明提供的检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒可以为单一试剂，例如，将L-丙氨酰 对硝基苯胺与缓冲液、稳定剂、激活剂制成单一试剂。本发明提供的检测丙氨酰氨基肽酶的 试剂盒也可以为双试剂。如，将缓冲液和金属离子激活剂制成第一试剂，将L-丙氨酰对硝 基苯胺和稳定剂制成第二试剂，在利用该试剂盒检测丙氨酰氨基肽酶时，将第一试剂与第 二试剂混合，从而检测待测样品中的丙氨酰氨基肽酶。
[0040] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0041] 实施例1 :本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒。
[0042] 本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒为液体单一试剂，包括：100mmol/ L pH7. 5?8. OTris-HCL缓冲液、10mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0. 2mmol/L叠氮钠、 0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸锋。
[0043] 实施例2 :本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒。
[0044] 本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒为双试剂，第一试剂包括lOOmmol/ L PH7. 5 ?8. OTris-HCL 缓冲液、0. 65mmol/L MgCl2 和 0. 5mmol/L 硫酸锌，第二试剂包括 10mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0. 2mmol/L叠氮钠。
[0045] 实施例3 :检测丙氨酰氨基肽酶的方法。
[0046] 设定全自动生化分析仪反应温度37°C，反应方法为速率法，测定主波长405nm，反 应方向为正反应，延迟时间90s，测量时间为120s，理论因数为2525。然后取待测样品与试 剂盒中的试剂置于全自动生化分析仪，仪器自动加样混合，检测并记录405nm波长下的吸 光度变化值。根据计算公式C# = A A#/minXK,计算待测样品中丙氨酰氨基肽酶的浓度， 其中，C#为待测样本浓度；AA#/min为样品每分钟吸光度变化率；K为理论因数，已设定为 2525。
[0047] 实施例4 :本发明所述试剂盒稳定性试验
[0048] 利用日立7080全自动生化分析仪，检测在2?8°C环境下保存不同时间的实施例 1所述试剂盒的空白吸光度，结果见表1。
[0049] 表1稳定性试验
【权利要求】
1. 一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，其特征在于，在pH7. 5?8. 0的缓冲液中，待测样 品与L-丙氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸 光度的变化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
4. 一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于，包括L-丙氨酰对硝基苯胺、 PH7. 5?8. 0的缓冲液和激活剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述L-丙氨酰对硝基苯胺浓度为8? 12mmol/L。
6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括稳定剂。
9.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为叠氮钠。
10.根据权利要求4所述试剂盒,其特征在于，包括80mmol/L?120mm ol/L pH7. 5? 8. OTris-HCL 缓冲液、8mmol/L ?1 2mmo1 /T, L-丙氛酸对硝基苯胺、0. lmmol/L ?0. 3mmol/L 叠氣纳、0. 5mmol/L ?0. 8mmol/LMgCl2 和 0. 2mmol/L ?0. 6m mol/L 硫酸锋。
【文档编号】G01N33/68GK104049090SQ201410310395
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】董理 申请人:长春汇力生物技术有限公司