超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法
【专利摘要】本发明超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法包括如下步骤，1)得到山茱萸粗粉；2)将山茱萸粗粉按料液比为1:5～1:25的比例加入体积分数为80％的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300～700W，超声功率120～600W的条件下提取3～15min得到提取液；3)将提取液抽滤后得到滤液，经定容过滤浓缩干燥纯化后得到本发明提供的山茱萸环烯醚萜苷。山茱萸环烯醚萜苷测定方法包括如下步骤，a.混合对照品溶液的制备；b.供试品溶液的制备，c.采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷的含量；d.根据液相色谱分析结果计算分别得到4种苷的含量。
【专利说明】超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于山茱萸环烯醚萜苷的提取和测定领域，具体为超声-微波协同提取的 山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法。
【背景技术】
[0002] 山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟 果肉，其味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱之功效，主治眩晕耳鸣、腰膝 酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴。主产于我国陕西、浙江和河南等 省，四川、安徽、山东、山西等地亦有栽培。山茱萸是常用中成药"六、八味地黄丸"、"杞菊地 黄丸"等的原料，为我国传统名贵中药材，是国家40种用量较大的重点药材之一。近年来， 国内外学者对山茱萸的多种有效成分进行了研究，从中分离得到环烯醚萜苷类、总多糖、鞣 质和皂苷等多种活性成分，莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山茱萸新苷为环烯醚萜苷类物质中 的主要成分，具有抗肿瘤、降血糖、保肝和调节免疫等药理作用。因此，山茱萸环烯醚萜苷的 开发及利用对人体的功能保健具有重要意义。
[0003] 山茱萸环烯醚萜苷的提取方法主要为索式提取、加热回流提取、超声辅助提取、微 波辅助提取、索式提取和加热回流提取这两种传统方法均具有提取时间长，提取率低，提取 物结构易被破坏等缺点。而环烯醚萜苷类成分性质大多不稳定，遇酸、高温等易分解，而索 式提取和加热回流提取法正是利用高温冷凝回流使原料成分析出，而单纯的超声辅助提取 可以利用超声波产生强烈的振动、空化和搅拌等作用，加速物质的溶解度和运动速度，但是 提取时间相对较长；微波辅助提取法具有选择性高、提取时间短等优点，但其受热不均匀。
[0004] 现有技术中，不仅对山茱萸环烯醚萜苷的提取方法不能满足要求，而且不能对提 取后得到产物中的有效物质的含量进行快速有效的同时分离和测定，测定山茱萸多种有效 成分的HPLC色谱方法具有色谱峰分离度低，且各色谱峰没有完全达到基线分离。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种操作简单，耗时短，提取效率高，检 测准确，重现性好的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷及其提取和测定方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] 本发明超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，包括如下步骤，
[0008] (1)将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核； 将剩余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉；
[0009] (2)称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:5?1:25的比例 加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300? 700W，超声功率120?600W的条件下提取3?15min得到提取液；
[0010] (3)将提取液抽滤后得到滤液，将滤液用80%的甲醇溶液补充至称定的重量，摇 匀过0. 22 μ m微孔滤膜，浓缩干燥，再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷。
[0011] 优选的，步骤2)中，1:15?1:25的比例加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封， 称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率500?700W，超声功率240?480W的条件下提取 6?12min得到提取液。
[0012] 优选的，步骤2)中，1:21的比例加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封，称定重 量，连接好冷凝装置，在微波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液。
[0013] 进一步的，料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条 件由响应面法优化得到，步骤如下；
[0014] 1)制备山茱萸环烯醚萜苷样品液；精密称取山茱萸粗粉l.OOg，置于反应瓶中， 加入80%甲醇溶液密封，称定重量，连接好回流装置，超声微波组合反应系统中提取，抽 滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0.22 μ m微孔滤膜，得到山茱萸环 烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、 0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，0. 22 μ m微孔滤膜过滤即得 1. 00mg/mL莫诺苷、0· 50mg/mL马钱苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新苷混合对 照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环 烯醚萜苷的含量；
[0015] 2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液 t匕、超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；
[0016] 3)响应面法优化；以山茱萸环烯醚廠苷提取率为响应因子，采用Design-Expert 软件中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二 次多元回归方程如下：
[0017] R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54 BD-0. 22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2
[0018] 其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比 的影响量，D为时间的影响量；
[0019] 4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚廠苷提取的最 佳条件为：料液比1:21. 45、微波功率640. 57W、超声功率356. 59W、时间9. 22min ;再以实际 操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率 360W、时间 9min。
[0020] 本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，由所述的任意一种所述的提 取方法制得。
[0021] 再进一步，山茱萸环烯醚萜苷至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四 种物质。
[0022] 本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，对再进一步中所述 的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步骤，
[0023] a.混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷 对照品1. 〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0. 22μπι微孔滤 膜过滤即得1. 〇〇mg/mL莫诺苷、0· 50mg/mL马钱苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱 萸新苷混合对照品溶液；
[0024] b.供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粉末1. 00g，置于X0-200型专 用玻璃反应瓶中，加入80%甲醇溶液2lmL密封，称定重量，连接好回流装置，于X0-200超 声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重量，摇 匀，过0. 22 μ m微孔滤膜作供试液；
[0025] c.测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量；具体如下，
[0026] 色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK 0DS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35°C ;检测波 长：240nm ;梯度洗脱条件：乙腈-0. 2%乙酸水溶液梯度洗脱，A为0. 2%乙酸水，B为乙腈； 流速：L 〇mL/min ;进样量：10 μ L ;
[0027] 以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下，
[0028] 0?15min，A从90%线性下降至80%，Β从10%线性增加至20% ;
[0029] 15?19min，Α从80%线性下降至78%，Β从20%线性增加至22% ;
[0030] 19?25min，A从78%线性下降至75%，B从22%线性增加至25% ;
[0031] 25?35min，A从75%线性下降至73%，B从25%线性增加至27% ;
[0032] 35?50min，A从73%线性下降至0%，B从27%线性增加至100%，
[0033] 50 ?55min，为 100% B 等度洗脱；
[0034] d.根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0036] 本发明所述提取方法通过将超声振动与脉冲式微波两种作用方式结合，利用微波 的高能作用与超声波的空化作用，实现对样品快速、高效、可靠地处理，是一种新型的提取 技术；其微波快速加热和超声波空化作用使样品获得足够的热转移和乳化特性，进而加速 了分子的热运动速度和相互碰撞作用，具有提取时间短、提取率高、提取物结构未被破坏等 优点；能够提高样品的提取率，缩短样品的制备时间，从而达到降低生产成本的目的。
[0037] 进一步的，由于中药提取过程中常常受到诸多因素的影响，响应面法和超声-微 波协同提取方法的有机结合不仅可以精确地找出整个区域上因素的最佳组合，而且可以确 定在试验范围内的任何试验点的预测值，通过将响应面分析法用于工艺条件的优化，精确 的表达因素和响应值之间的关系，同时可根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数， 得到最佳工艺参数。相比现有的正交设计、索式提取、回流提取和单独的超声波辅助提取或 微波辅助提取法，采用响应面法优化的超声-微波提取工艺更为精准，能够更好的将山茱 萸环烯醚萜苷的提取用于工业化生产；比索式提取法提高了 36. 13%，超声辅助提取法提 高了 28.00%，比微波辅助提取法提高了 10. 22%。
[0038] 本发明所述测定方法，采用高效液相紫外检测法，结合0. 2%乙酸水溶液-乙腈流 动相梯度洗脱，实现同时测定山茱萸中4种环烯醚萜苷的含量。本发明所建立的色谱方法 能够较好地分离和测定山茱萸中4种环烯醚萜苷的含量，其色谱峰峰形好，分离度高，能够 准确地测定山茱萸药材中4种环烯醚萜苷的含量。本方法操作简单，精密度、重现性和稳定 性良好，可为山茱萸环烯醚萜苷的分离纯化和质量标准控制提供科学依据，并且能够通过 HPLC法同时对山茱萸中4种环烯醚萜苷含量的测定，更好的优化最佳的超声-微波协同提 取工艺，从而为山茱萸环烯醚萜苷的药理作用及生产实践方面的应用提供基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1 :料液比对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。
[0040] 图2 :提取时间对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。
[0041] 图3 :超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。
[0042] 图4 :微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量的影响示意图。
[0043] 图5 :超声功率和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，5a为响应面图， 5b为等高线图。
[0044] 图6 :料液比和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，6a为响应面图，6b 为等1?线图。
[0045] 图7 :提取时间和微波功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，7a为响应面图， 7b为等高线图。
[0046] 图8 :料液比和超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，8a为响应面图，8b 为等1?线图。
[0047] 图9 :提取时间和超声功率对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，9a为响应面图， 9b为等1?线图。
[0048] 图10 :提取时间和料液比对山茱萸环烯醚萜苷含量影响示意图，10a为响应面图， l〇b为等高线图。
[0049] 图11 :对照品图色谱图，其中：1_莫诺苷，2-马钱苷，3-獐芽菜苷，4-山茱萸新苷。
【具体实施方式】 [0050]
[0051] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0052] 本发明超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，包括如下步骤，1)将新鲜 成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩余的果肉干燥后 粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉；
[0053] 2)称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:5?1:25的比例 加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300? 700W，超声功率120?600W的条件下提取3?15min得到提取液；3)将提取液抽滤后得到 滤液，将滤液用80 %的甲醇溶液补充至称定的重量，摇匀过0. 22 μ m微孔滤膜，浓缩干燥， 再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷。
[0054] 本优选实施例中还能够在步骤2)中，以1:15?1:25的比例加入体积分数为80% 的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率500?700W，超声功率240? 480W的条件下提取6?12min得到提取液。除了以上所述的两个范围的端点值外，具体的 以，1:21的比例加入体积分数为80 %的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微 波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液为例，以其中的点值进行说明， 同时还能够取到限定范围内的其他值。
[0055] 其中，料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条件由 响应面法优化得到，步骤如下；
[0056] 1)制备山茱萸环烯醚萜苷样品液；精密称取山茱萸粗粉l.OOg，置于反应瓶中， 加入80%甲醇溶液密封，称定重量，连接好回流装置，超声微波组合反应系统中提取，抽 滤，所得滤液再用80 %甲醇溶液补至原重量，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到山茱萸环 烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品1.00、 0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，0. 22μπι微孔滤膜过滤即得 1. 00mg/mL莫诺苷、0· 50mg/mL马钱苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新苷混合对 照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环 烯醚萜苷的含量；
[0057] 2)单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液 t匕、超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验；
[0058] 3)响应面法优化；以山茱萸环烯醚廠苷提取率为响应因子，采用Design-Expert 软件中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二 次多元回归方程如下：
[0059] R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54 BD-0. 22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2
[0060] 其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比 的影响量，D为时间的影响量；
[0061] 4)通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚廠苷提取的最 佳条件为：料液比1:21. 45、微波功率640. 57W、超声功率356. 59W、时间9. 22min ;再以实际 操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率 360W、时间 9min。
[0062] 本发明中所述的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，由以上所述的提取方 法制得。优选的山茱萸环烯醚萜苷至少包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物 质。
[0063] 本发明超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，对至少包括莫诺 苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步 骤，
[0064] a.混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新 苷对照品1. 〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0. 22μπι微孔 滤膜过滤即得1. 00mg/mL莫诺苷、0. 50mg/mL马钱苷、0. 10mg/mL猜芽菜苷和0. 20mg/mL山 茱萸新苷混合对照品溶液；
[0065] b.供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粉末1. 00g，置于X0-200型专 用玻璃反应瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，称定重量，连接好回流装置，于X0-200超 声微波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重量，摇 匀，过0. 22 μ m微孔滤膜作供试液；
[0066] c.测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量；具体如下，
[0067] 色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK 0DS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35°C ;检测波 长：240nm ;梯度洗脱条件：乙腈-0. 2%乙酸水溶液梯度洗脱，A为0. 2%乙酸水，B为乙腈； 流速：L 〇mL/min ;进样量：10 μ L ;
[0068] 以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下，
[0069] 0?15min，A从90%线性下降至80%，B从10%线性增加至20% ;
[0070] 15?19min，A从80%线性下降至78%，B从20%线性增加至22% ;
[0071] 19?25min，A从78%线性下降至75%，B从22%线性增加至25% ;
[0072] 25?35min，A从75%线性下降至73%，B从25%线性增加至27% ;
[0073] 35?50min，A从73%线性下降至0%，B从27%线性增加至100%，
[0074] 50 ?55min，为 100% B 等度洗脱；
[0075] d.根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷 和山茱萸新苷的含量。
[0076] 为了确定本发明的最佳原料配比和最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研 究试验，具体的试验情况如下。
[0077] 仪器与试药
[0078] 仪器：LC-2010A HT型高效液相色谱仪（日本SHIMADZU)，超纯水仪（美国 Millipore公司），精密微量移液器（德国Eppendorf公司），Centrifuge5804R冷冻台式离 心机（德国Eppendorf公司），FA2004N型电子分析天平（上海天平仪器总厂），X0-200微 波超声波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司），DFT-50手提式粉碎机（温岭市林 大机械有限公司），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHB-HIA型循环水式多 用真空泵（陕西太康生物科技有限公司）。
[0079] 试剂：马钱苷（成都曼斯特生物，批号：MUST-12052813,纯度：> 98% );猜牙菜苷 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130311 :纯度：彡98% );莫诺苷（天津一方生物 科技有限公司，批号：MUST-13070102,纯度：彡98% );山茱萸新苷（成都普菲德生物技术 有限公司，批号：121015,纯度：彡98% )甲醇为分析纯（河北天力试剂有限公司）；乙腈， 冰乙酸均为色谱醇（美国Fisher公司）；水为超纯水。
[0080] 药材：山茱萸于2011年10月至11月采集于河南西峡，经陕西师范大学肖婭萍教 授鉴定为山茱萸科山茱萸（Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.)的干燥成熟果肉，50°C烘 干，粉碎后过40目筛，备用。
[0081] 方法与结果
[0082] 混合对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对 照品1. 00、0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0. 22μπι微孔滤膜 过滤即得1. 〇〇mg/mL莫诺苷、0· 50mg/mL马钱苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸 新苷混合对照品溶液。
[0083] 供试品溶液的制备：精密称取过40目筛的山茱萸粉末1. 00g，置于X0-200型专用 玻璃反应瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，称定重量，连接好回流装置，于X0-200超声微 波组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重量，摇匀， 过0. 22 μ m微孔滤膜作供试液。
[0084] 色谱条件
[0085] 色谱柱：JADE-PAK 0DS-AQ C18 极性色谱柱（250mmX 4. 6mm，5 μ m)，柱温：35°C，流 速：1. OmL/min，检测波长：240nm，进样量：10 μ L。流动相：A为0. 2%乙酸水，B为乙腈；梯度 洗脱条件：〇 ?15min，10%?20% B ;15 ?19min，20%?22% B ;19 ?25min，22%?25% B ;25 ?35min，25%?27% B ;35 ?50min，27%?100% B ;50 ?55min，100% B 等度洗脱。 山茱萸对照品色谱图见图11。
[0086] 方法学考察
[0087] 线性关系考察
[0088] 依次进已配制的莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和莫诺苷混合对照品溶液1、4、10、 14、18 μ L，于240nm波长下检测各物质的峰面积，以峰面积值为纵坐标，各对照品含量为横 坐标进行线性回归，得回归方程。结果详见表1。
[0089] 表1线性关系试验结果（η = 3)
[0090] Table 1 Linear relation between peak area and concentration, n = 3
[0091]
【权利要求】
1. 超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其特征在于，包括如下步骤， (1) 将新鲜成熟的山茱萸果实在开水中浸泡数分钟后，流水冲洗冷却，剥除果核；将剩 余的果肉干燥后粉碎，过40目筛，得到山茱萸粗粉； (2) 称取一定量的山茱萸粗粉，置于反应容器中，按料液比为1:5?1:25的比例加入体 积分数为80 %的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好冷凝装置，在微波功率300?700W，超 声功率120?600W的条件下提取3?15min得到提取液； (3) 将提取液抽滤后得到滤液，将滤液用80%的甲醇溶液补充至称定的重量，摇匀过 0. 22 μ m微孔滤膜，浓缩干燥，再经纯化后得到山茱萸环烯醚萜苷。
2. 根据权利要求1所述的超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其特征在 于：所述的步骤（2)中，1:15?1:25的比例加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封，称定 重量，连接好冷凝装置，在微波功率500?700W，超声功率240?480W的条件下提取6? 12min得到提取液。
3. 根据权利要求1所述的超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其特征在于： 所述的步骤（2)中，1:21的比例加入体积分数为80%的甲醇溶液并密封，称定重量，连接好 冷凝装置，在微波功率641W，超声功率360W的条件下提取9min得到提取液。
4. 根据权利要求3所述的超声-微波协同提取山茱萸环烯醚萜苷的方法，其特征在于： 所述的料液比1:21，微波功率为641W，超声功率为360W和时间9min的提取条件由响应面 法优化得到，步骤如下； 1) 制备山茱萸环烯醚萜苷样品液； 精密称取山茱萸粗粉1. 〇〇g，置于反应瓶中，加入80%甲醇溶液密封，称定重量，连接 好回流装置，在超声-微波协同作用下中提取，抽滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重 量，摇匀，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到山茱萸环烯醚萜苷样品液备用；分别精密称取莫诺苷、 马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照品l.〇〇、〇. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，用色谱甲 醇溶解并定容，〇. 22 μ m微孔滤膜过滤即得1. 00mg/mL莫诺苷、0. 50mg/mL马钱苷、0. 10mg/ mL獐芽菜苷和0. 20mg/mL山茱萸新苷混合对照品溶液；绘制标准曲线得线性回归方程，并 根据线性回归方程计算出山茱萸样品液中环烯醚萜苷的含量； 2) 单因素实验；根据步骤1)中山茱萸环烯醚萜苷样品液的制备方法，分别按料液比、 超声功率、微波功率和提取时间四个单因素设计若干组单因素实验； 3) 响应面法优化；以山茱萸环烯醚廠苷提取率为响应因子，采用Design-Expert软件 中的Box-Behnken原理在步骤2)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多 元回归方程如下： R1 = 26. 25+0. 49A-0. 098B+1. 42C-0. 080D+0. 21AB+0. 65AC+0. 88AD-0. 29BC+0. 54BD-0 .22CD-0. 91A2-1. 02B2-2. 89C2 其中，R1为相应因子，A为微波功率的影响量，B为超声功率的影响量，C为料液比的影 响量，D为时间的影响量； 4) 通过Design-Expert软件对回归方程的求解，得到山茱萸环烯醚廠苷提取的最佳 条件为：料液比1:21.45、微波功率640.571、超声功率356.591、时间9.2211^11 ;再以实际 操作为约束条件，将修正得到最佳提取工艺参数为：料液比1:21、微波功率641W、超声功率 360W、时间 9min。
5. 超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，其特征在于，所述的山茱萸环烯醚萜苷 由权利要求1-4中任意一项所述的提取方法制得。
6. 根据权利要求5所述的超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷，其特征在于，至少 包括莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷四种物质。
7. 超声-微波协同提取的山茱萸环烯醚萜苷的测定方法，其特征在于，对权利要求6所 述的山茱萸环烯醚萜苷进行测定，包括如下步骤， a. 混合对照品溶液的制备；分别精密称取莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷对照 品1. 00、0. 50、0. 10、0. 20mg，置lmL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，0. 22μπι微孔滤膜过 滤即得1. 〇〇mg/mL莫诺苷、0· 50mg/mL马钱苷、0· 10mg/mL猜芽菜苷和0· 20mg/mL山茱萸新 苷混合对照品溶液； b. 供试品溶液的制备，精密称取过40目筛的山茱萸粗粉l.OOg，置于X0-200型专用玻 璃反应瓶中，加入80 %甲醇溶液2lmL密封，称定重量，连接好回流装置，于X0-200超声微波 组合反应系统中提取9min，取出，抽滤，所得滤液再用80%甲醇溶液补至原重量，摇匀，过 0. 22 μ m微孔滤膜作供试液； c. 测定法；采用HPLC-UV法测定混合对照品及供试品中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山 茱萸新苷的含量；具体如下， 色谱条件：色谱柱：采用JADE-PAK 0DS-AQ色谱柱为C18柱；柱温：35°C ; 检测波长：240nm ; 梯度洗脱条件：乙腈-〇. 2%乙酸水溶液梯度洗脱，A为0. 2%乙酸水，B为乙腈；流速： 1. OmL/min ;进样量：10 μ L ; 以体积百分比计算，梯度洗脱阶段如下， 0?15min，Α从90%线性下降至80%，Β从10%线性增加至20% ; 15?19min，A从80%线性下降至78%，B从20%线性增加至22% ; 19?25min，A从78%线性下降至75%，B从22%线性增加至25% ; 25?35min，A从75%线性下降至73%，B从25%线性增加至27% ; 35?50min，A从73%线性下降至0%，B从27%线性增加至100%， 50?55min，为100% B等度洗脱； d. 根据液相色谱分析结果计算分别得到山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷和山 茱萸新苷的含量。
【文档编号】G01N30/36GK104147079SQ201410325551
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】康杰芳, 杨宁, 王红菊, 王韶君, 白嫄, 王喆之 申请人:陕西师范大学