化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法
【专利摘要】化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法，检测步骤如下：配制甲醇-水醋酸铵溶液和醋酸铵溶液；配制用于标准曲线绘制的标准溶液；液相色谱分析；质谱确证；样品溶液的制备；定性分析；定量测定；用标准曲线外标法确定样品溶液中目标物的含量，。本方法具有简便易行、成本低、精准度高、14种禁用着色剂可同时检测的优点。
【专利说明】化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测方法，特别是一种化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方 法。
【背景技术】
[0002] 着色剂(也称色素）作为化妆品原料之一，在化妆品中广泛使用。普通化妆品中使 用着色剂的目的是用来使产品着色，还可以调整某些原料对产品色调的影响，用以区分不 同的产品品种。在彩妆化妆品中使用则主要起到美化、修饰的作用。
[0003] 着色剂按照性能和着色方式可分为染料和颜料两大类，染料又分为天然染料和合 成染料，颜料则分为无机颜料和有机颜料。按照来源方式，可分为天然着色剂和合成着色 剂两大类。其中天然染料和无机颜料一般属于天然着色剂，合成着色剂则包括合成染料及 有机颜料。大多数的合成着色剂多来自煤焦油产物，往往会对人体造成不同程度的危害，例 如，导致生育能力下降、畸胎，甚至诱发癌症，一些合成色素可引起光敏反应。目前，化妆品 对于一些人而言已成为生活必需品，为安全起见，世界上许多国家均对化妆品用着色剂作 了相关规定。我国《化妆品卫生规范》（2007)参照《欧盟化妆品规程》并结合中国的特点， 对化妆品用着色剂的品种、使用范围和限制条件都做出了明确的规定。
[0004] 卫生部《化妆品卫生规范》（2007版)禁用物质列表中明确涉及的着色剂包括联苯 胺基偶氮染料(第270条)，邻-联茴香胺基偶氮染料(第926条)，邻-联甲苯胺基染料(第 931条)外，还包括第369-378条共10条(涉及13种着色剂)，第310条(苏丹I)和第451条 (分散黄3)。根据毒理学实验数据给出评估的结果表明，在化妆品中使用禁用着色剂能引起 皮肤过敏、毒性反应、甚至诱发癌症。
[0005] 《化妆品卫生规范》（2007版）虽然给出了禁用的着色剂原料表，但同时并未给出 化妆品诸多着色剂检测相应的标准检测方法，这就给生产监管和产品品质保证造成了技术 上的困难。因此，有必要研制快速、准确、灵敏的检测方法，为化妆品的质量监管提供有效的 技术支持和有力保障。
[0006] 目前，对化妆品中着色剂的检测，国内外有文献报道的方法包括：薄层色谱法、胶 束电动色谱法、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS)、高效液相色谱-紫外可见检测法 (HPLC- UV)及高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD)。所查文献中共涉及禁用着色 剂 11 种（苏丹红 IV(C.I. 26105)、酸性紫 49(C.I. 42640)、苏丹蓝 2(C.I. 61554)、溶剂 红 49 (C.I. 45170:1)、碱性紫 1(C.I. 42535)、颜料橙 5 (C.I. 12075)、酸性黄 36 (C.I. 13065)、颜料红 53:1 (C.I. 15585:1)、苏丹红 II(C.I. 12140)及罗丹明B(C.I. 45170)， 单种方法最多涉及禁用着色剂7种（苏丹红IV (C.I. 26105)、酸性紫49 (C.I. 42640)、苏 丹蓝 2 (C.I. 61554)、溶剂红 49 (C.I. 45170:1)、碱性紫 1(C.L 42535)、颜料橙 5(C.I. 12075)、颜料红 53 (C.I. 15585))。
[0007] 样品前处理大多采用溶剂萃取、固相萃取、液液萃取等方法。色谱分离均采用常用 的C18色谱柱，流动相则多用甲醇或乙腈与磷酸盐或醋酸铵缓冲液的梯度洗脱程序，也有 用四丁基氢氧化铵做离子对试剂来增强水溶性目标物的色谱保留。检测波长则多采用240 nm，480 nm，520 nm等波长。液质联用在着色剂检测领域的应用目前还不十分普遍。
[0008] 在检测标准领域，目前化妆品着色剂检测尚无任何现行的国家标准。国标计划 20090914-T-607《化妆品中罗丹明B等4种禁用着色剂的测定高效液相色谱法》，涉及4种 禁用着色剂，目前处于标准报批阶段，尚未正式发布。国家食品药品监督管理局发布化妆品 检测方法中，国食药监保化[2012] 13号附件15方法，涉及5种禁用着色剂(酸性黄36(C. I. 13065)、颜料橙 5 (C.I. 12075)、颜料红 53:1 (C.I. 15585:1)、苏丹红 II(C.I. 12140)和 苏丹红IV(C. I. 26105))。通过文献研究发现，现有检测方法和手段很难满足目前化妆品领 域对禁用着色剂使用安全的质量监管要求。化妆品中禁用着色剂多组分检测尚存在很大的 研究空白。这使得化妆品尤其是彩妆类化妆品的质量安全引发社会的广泛关注。为此，力口 快化妆品中禁用着色剂的检测方法开发，满足日益增长的化妆品安全监管需要，意义尤为 重大。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种简便易行、14种禁用着色剂可同时检测、提高工作效率、 降低检测成本的化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法，克服现有技术的不足。
[0010] 本发明的化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法，所述的着色剂为：吖啶黄、 溶剂蓝35、溶剂红49、酸性紫49、氯化四甲基副玫瑰苯胺、颜料橙5、颜料红53、氯化五甲基 副玫瑰苯胺、苏丹红II、氯化六甲基副玫瑰苯胺、苏丹红IV、罗丹明B、分散黄3、苏丹I ;其 特征在于：检测步骤如下： (1) 盐溶液的配制 将醋酸铵加入到甲醇和水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1 : 1，醋酸铵充分溶解 后得甲醇-水醋酸铵溶液，醋酸铵浓度为50 ~250 mmol/L ; 将醋酸铵加入到水中充分溶解，制得浓度为10?50 mmol/L的醋酸铵溶液； (2) 标准溶液的配制 分别等量称取吖啶黄、溶剂蓝35、溶剂红49、酸性紫49、氯化四甲基副玫瑰苯胺、颜料 橙5、颜料红53、氯化五甲基副玫瑰苯胺、苏丹红II、氯化六甲基副玫瑰苯胺、苏丹红IV、罗 丹明B、分散黄3、苏丹I并置于同一容量瓶中，用体积比为1 : 1的甲醇和四氢呋喃溶液充 分溶解并定容至刻线，配制成各目标物浓度均为20 μ g/mL的混合标准溶液，再用体积比 为1 : 1的甲醇和四氢呋喃溶液逐级稀释配制一系列各目标物浓度分别为5、2、1、0.5、0.2 μ g/mL的混合标准溶液，用于标准曲线的绘制； (3) 样品溶液的制备： 称取待测化妆品样品置于离心管中，向离心管内加入四氢呋喃，待测化妆品与四氢呋 喃的用量比为0.2 g : 6 mL，涡旋并超声10 min，使样品分散或用80 °C水浴并适当加热 1~2 min，提取目标物，向离心管中加入第（1)步所得的甲醇-水醋酸铵溶液，四氢呋喃与甲 醇-水醋酸铵溶液的用量比为6 mL : 4 mL，使提取溶液定容至四氢呋喃与甲醇-水醋酸铵 溶液之和，涡旋混匀后超声10 min，然后于5000 r/min离心10 min;取澄清提取液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后待测； (4) 液相色谱分析，参考条件如下： 色谱柱：P〇roshell 120 EC-C18,2.7ym，3.0 mmXlOO mm 或者相当者；柱温：35 °C ; 流速：0· 5 mL/min ;进样量：2 μ L ;用DAD检测器检测波长：416 nm、514 nm、590 nm ;流动 相：A为第（1)步制得的10?50 mmol/L醋酸铵溶液，B乙腈，梯度洗脱； (5) 质谱确证，参考条件如下： 液相色谱条件：色谱柱：P〇roshell 120 EC_C18,2.7 μηι，3·0 mmXlOO mm或者相当者； 流速：0. 5 μ L/min ;进样量：2 μ L ;流动相：A水相溶液，负模式为10mm〇l/L醋酸铵溶 液；正模式为〇. 33%。甲酸溶液，B有机相溶液，负模式为乙腈和甲醇，乙腈和甲醇的体积比 为6 : 4;正模式为乙腈，梯度洗脱； 质谱参考条件：离子源：电喷雾电离源（ESI源）;检测方式：多反应监测（MRM);雾化气： 氮气，35 Psi ;干燥气：氮气，流速10 L/min，温度：350 °C ;碰撞气：氮气；碰撞电压：380V ; 毛细管电压：4000 V ;其他质谱参数如下： 目标物的质谱分析参考参数
【权利要求】
1. 一种化妆品中14种禁用着色剂同时检测的方法，所述的着色剂为：吖啶黄、溶剂蓝 35、溶剂红49、酸性紫49、氯化四甲基副玫瑰苯胺、颜料橙5、颜料红53、氯化五甲基副玫瑰 苯胺、苏丹红II、氯化六甲基副玫瑰苯胺、苏丹红IV、罗丹明B、分散黄3、苏丹I ;其特征在 于：检测步骤如下： (1) 盐溶液的配制 将醋酸铵加入到甲醇和水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1 : 1，醋酸铵充分溶解 后得甲醇-水醋酸铵溶液，醋酸铵浓度为50 ~250 mmol/L ; 将醋酸铵加入到水中充分溶解，制得浓度为10?50 mmol/L的醋酸铵溶液； (2) 标准溶液的配制 分别等量称取吖啶黄、溶剂蓝35、溶剂红49、酸性紫49、氯化四甲基副玫瑰苯胺、颜料 橙5、颜料红53、氯化五甲基副玫瑰苯胺、苏丹红II、氯化六甲基副玫瑰苯胺、苏丹红IV、罗 丹明B、分散黄3、苏丹I并置于同一容量瓶中，用体积比为1 : 1的甲醇和四氢呋喃溶液充 分溶解并定容至刻线，配制成各目标物浓度均为20 μ g/mL的混合标准溶液，再用体积比 为1 : 1的甲醇和四氢呋喃溶液逐级稀释配制一系列各目标物浓度分别为5、2、1、0. 5、0. 2 μ g/mL的混合标准溶液，用于标准曲线的绘制； (3) 样品溶液的制备： 称取待测化妆品样品置于离心管中，向离心管内加入四氢呋喃，待测化妆品与四氢呋 喃的用量比为0.2 g : 6 mL，涡旋并超声10 min，使样品分散或用80 °C水浴并适当加热 1~2 min，提取目标物，向离心管中加入第（1)步所得的甲醇-水醋酸铵溶液，四氢呋喃与甲 醇-水醋酸铵溶液的用量比为6 mL : 4 mL，使提取溶液定容至四氢呋喃与甲醇-水醋酸铵 溶液之和，涡旋混匀后超声10 min，然后于5000 r/min离心10 min;取澄清提取液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后待测； (4) 液相色谱分析，参考条件如下： 色谱柱：P〇roshell 120 EC_C18,2.7ym，3.0 mmXlOO mm 或者相当者；柱温：35 °C ; 流速：0· 5 mL/min ;进样量：2 μ L ;用DAD检测器检测波长：416 nm、514 nm、590 nm ;流动 相：A为第（1)步制得的10?50 mmol/L醋酸铵溶液，B乙腈，梯度洗脱； (5) 质谱确证，参考条件如下： 液相色谱条件：色谱柱：P〇roshell 120 EC_C18,2.7 μηι，3·0 mmXlOO mm或者相当者； 流速：0. 5 μ L/min ;进样量：2 μ L ;流动相：A水相溶液，负模式为10mm〇l/L醋酸铵溶 液；正模式为〇. 33%。甲酸溶液，B有机相溶液，负模式为乙腈和甲醇，乙腈和甲醇的体积比 为6 : 4;正模式为乙腈，梯度洗脱； 质谱参考条件：离子源：电喷雾电离源（ESI源）;检测方式：多反应监测（MRM);雾化气： 氮气，35 Psi ;干燥气：氮气，流速10 L/min，温度：350 °C ;碰撞气：氮气；碰撞电压：380V ; 毛细管电压：4000 V ;其他质谱参数如下： 目标物的质谱分析参考参数
(6) 定性分析 分别将第（2)步取得的标准溶液和第（3)步取得的样品溶液按照第（4)步所述最优液 相分析参考条件进行分析，将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱 图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的 保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱 一致，则可初步认定样品中存在该物质；经液相色谱法确定为阳性的样品，必须经第（5)步 所述的质谱确证参考条件进行质谱分析进一步确证； (7) 定量测定 移取第（2)步系列标准溶液，按照第（4)步色谱条件进行高效液相色谱分析，以系列标 准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线；吖啶黄和分散黄3根据416 nm 下的紫外吸收进行定量计算，颜料红53、溶剂红49、颜料橙5、苏丹I、苏丹红II、苏丹红IV、 碱性紫10根据514 nm下的紫外吸收进行定量计算，酸性紫49、氯化四甲基副玫瑰苯胺、氯 化五甲基副玫瑰苯胺、氯化六甲基副玫瑰苯胺、溶剂蓝35根据590 nm下的紫外吸收进行定 量计算； 鉴于碱性紫10实为溶剂红49的盐酸盐，在本方法中与溶剂红49的出峰时间相同，方 法无法分辨是碱性紫10或溶剂红49。
2.除非已知，否则为统一测试结果，建议选择溶剂红49作为标准物质，测试结果则报 告以溶剂红49计的含量； 样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定；化妆品样品中目标物的含量按"公 式（1)"进行计算；
式中--从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，μ g/mL ; V--按稀释倍数折算的被测样液总体积，mL ; m 称取样品的质量，g ; 计算结果保留三位有效数字； 若待测溶液中目标物的质量浓度超过校准曲线线性范围的上限，须对待测液进行适当 稀释后重新测定。
【文档编号】G01N30/88GK104122359SQ201410362344
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】毛希琴, 任国杰, 李春玲, 张国翠 申请人:大连市产品质量监督检验所