倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法及应用的制作方法

倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种倍硫磷分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用，属分析化学领域。其以倍硫磷为模板分子，将倍硫磷溶解于致孔剂中，加入功能单体后于低温下预聚合。再加入交联剂和引发剂，将混合液滴入预先准备好的聚乙烯醇溶液中，采用悬浮聚合法制备倍硫磷分子印迹聚合物微球。所得聚合物微球经漂洗、过筛和干燥等一系列处理后，湿法填充于固相萃取柱空柱管中，经丙酮和甲醇依次润洗后用于食品中残留倍硫磷的选择性吸附、富集和纯化。本发明所制备的分子印迹固相萃取柱较已有的固相萃取柱具有特异性强、制备简便、后处理简单、聚合物表面识别位点破坏^少，识别性能好、成本低廉、所需仪器和反应条件；容易实现等特点。5
【专利说明】倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法及应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学领域，具体是一种倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法及其在食品中倍硫磷残留分析时样品前处理方面的应用。

【背景技术】
[0002]有机磷类药物广泛用于控制或消灭农业、林业病虫害以及畜禽体表寄生虫，该类化合物进入有机体，对生物体内胆碱酯酶有抑制作用，抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱积累，引起神经功能紊乱，从而导致对肌体的损害。倍硫磷是有机磷类药物的一种，属于广谱、速效和中等毒力的有机磷杀虫剂，对螨类也有较好效果，具有触杀和胃毒作用，渗透性较强，有一定的内吸作用，残效期长。为了避免倍硫磷的残留，许多国家和国际组织建立了其残留检测方法并对其残留限量作了规定。我国农业部第235号公告规定了牛、猪和禽可食性产品中的最大残留限量为lOOyg/kg。我国食品安全国家标准GB2763 -2012规定倍硫磷在蔬菜、谷物和水果中的最大残留限量为50 μ g/kg，在油料制品中的最大残留限量为10 μ g/kg。
[0003]倍硫磷的化学性质不稳定，易分解，半衰期短，不易在作物、动物和人体内蓄积，因而得到广泛使用。但由于使用范围越来越广，使用频率越来越高，施用量越来越大，已成为食品中残留最为严重的化学药物之一。根据倍硫磷的物理、化学及生物学特性，目前常用的检测方法有:酶抑制法、酶联免疫分析法和仪器分析方法等。酶抑制法操作简便，速度快，不需昂贵的仪器，特别适合现场检测及大批样品的筛选检测，但灵敏度较差，并且对各类不同有机磷农药检测的灵敏度不同，重复性、回收率还有待提高。酶联免疫法检测的灵敏度高，精确度高，方法的特异性强，方便快捷，但是对试剂的选择性高，对于小分子物质进行检测时要合成相应的人工抗原，抗原的合成不仅工作量大、周期长，而且结构类似的药物或待测代谢物可能发生不同程度的交叉反应。仪器分析方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法。其中，薄层色谱法操作简单，便于掌握，定性准确，但是定量测定准确度和灵敏度低，是一种常用的定性测定方法。色谱-质谱联用法的检测灵敏度虽然很高，但价格相对昂贵，而色谱法检出限较高，不能满足痕量农药残留和出口贸易检测的实际需要，且在分析之前常需要进行样品的净化和富集。由于许多食品和农产品的样品基质复杂，干扰物质较多，前处理步骤比较繁琐。因此，亟需开发选择性强和分离效果好的样品前处理方法。
[0004]固相萃取(Solid Phase Extract1n, SPE)是近年来迅速发展起来的专门用于样品纯化和浓缩的一项技术，被广泛应用于多种复杂样品的前处理过程中。与液液萃取相比，SPE可以更有效地将分析物与干扰物分离，减少样品前处理过程，使操作更加简便、高效、省时和省力。SPE进行萃取的机理就是依靠目标物质与填料表面活性基团的一系列作用力来进行样品的净化，萃取的效果在很大程度上依赖于固相填充剂的选择。填充剂表面存在一系列活性基团，传统的SPE填充材料主要为氧化铝、CS和C18硅烷等，这一类传统填充材料的选择性较差，在对目标物质进行富集的同时，样品中的大量基质以及非目标分子的干扰物质也同时被富集，这就会导致洗脱液中含有不同含量的基质和杂质，这些物质会对色谱分离和分析产生干扰，影响样品分析的效果。分子印迹技术作为一种能够获得在空间和结合位点上与某种分子完全匹配的聚合物制备技术，它具有构效的预定性、识别的特异性和广泛的实用性，可以特异性地识别萃取物，而且制备方法简单，性质稳定，能够适用于多种环境条件，比较适合用作SPE填料。将分子印迹技术与SPE相结合，综合二者的优点，开发基于分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)的SPE方法,将简化样品的前处理过程，减少检测过程中的干扰，该方法已在化学物的残留分析中展现出广阔的发展前景。
[0005]本发明采用悬浮聚合法制备倍硫磷的MIPs，所制备的分子印迹微球经漂洗、过筛、干燥和洗脱等一系列处理后，再通过高效液相色谱法对其性能进行评价分析即可得到识别性较好的聚合物材料。


【发明内容】

[0006]本发明的目的是克服现有固相萃取方法的不足，采用悬浮聚合法制备倍硫磷MIPs微球，用作固相萃取的萃取介质，用于食品样品中倍硫磷的分离、富集和痕量检测。该固相萃取柱具有专一识别性、制备过程简单、反应条件易于实现等优点。
[0007]为了实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为:一种倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，包括以下步骤:
1)将模板分子溶于致孔剂中，然后加入功能单体，超声混匀5min，放入4°C冰箱进行预聚合24h，得到预聚合体系；
所述的模板分子为倍硫磷，致孔剂为氯仿，功能单体为甲基丙烯酸、4-乙烯基吡唆、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡唆、烯丙基胺、亚甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(双甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子与功能单体的比例为1:4-8，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为20mmol/L-70mmol/L ；
2)向步骤I)制得的预聚合体系中加入交联剂与引发剂，超声清洗仪中进行超声5min，混匀后通入氮气5min，然后在氮气气氛或真空状态下密封；
所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇双丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600)二甲基丙烯酸酯、马来松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇单酯、六亚甲基二异氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一种，加入量为功能单体的5倍，所述的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异戊腈、偶氮二环己基甲腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的任意一种，加入量为步骤I)所加功能单体摩尔量的0.5-1.5倍；
3)按照分散剂与步骤I)所加功能单体比值为lOmL/mmol-lOOmL/mmol的比例取一定量的分散剂置于四口烧瓶中；
所述的分散剂为，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液。其中聚乙烯醇1788水溶液配制时，先将聚乙烯醇1788加入蒸馏水中，加热至90°C _95°C使其溶解，形成6%_9%的聚乙烯醇1788溶液，冷却至室温，转至四口烧瓶中；
4)将2)所得的反应体系在搅拌和氮气保护下滴加入步骤3)的四口烧瓶中引发聚合，引发温度为45°C _65°C，聚合时间为8h-36h，得到微悬浮乳液，即为MIPs ；
5)将4)中的MIPs在丙酮中用湿筛法过筛，对颗粒大小进行分级，除去粒径较小和较大的微球，选出直径50 μ m-70 μ m的颗粒，用滤纸包好，用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液进行索氏抽提，期间进行取样，对索氏抽提液进行高效液相色谱分析，测定模板分子的含量，直至模板分子无法检出，停止索氏抽提；然后将得到的聚合物45°C烘干至恒重，得到对倍硫磷具有识别能力的MIPs微球；
6)称取5)中制备的MIPs100mg-200mg,用湿法填装固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮对柱子进行润洗，即得到倍硫磷分子印迹固相萃取小柱，然后封于锡箔袋中备用。
[0008]所述步骤3)中聚乙烯醇1788溶液的质量浓度为7%_8%。
[0009]所述步骤4)中的引发温度为50°C _60°C，聚合时间为12h_24h。
[0010]所述步骤4)中的搅拌速度为400r/min。
[0011]倍硫磷分子印迹固相萃取小柱用于食品中残留倍硫磷的选择性吸附和富集时，首先用3mL-7mL甲醇和3mL_7mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)润洗，2mL-7mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡，加入浓缩后的样品提取液lmL-5mL,经3mL_8mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)淋洗后，用5mL-10mL甲醇-乙酸混合液(9:1, v/v)洗脱。
[0012]本发明的有益效果:
1、本发明所提供的分子印迹固相萃取小柱可用于食品中倍硫磷的分离与富集，其制备过程操作简单、方便快速，对极端环境耐受力强，较适合基层单位检验或现场处理样品时使用。
[0013]2、本发明制得的倍硫磷分子印迹固相萃取小柱与传统的固相萃取柱相比，所需生产成本低，聚合物的后处理简单，无需研磨和装柱，不会破坏聚合物的结构，且所得SPE固定相的大孔结构可以保证较快的传质速率和较低的柱压，制得的萃取小柱对样品中杂质的净化效果好，检测结果的精密度高，专一性强，回收率高且稳定性好，适合推广使用。
[0014]3、制备过程中先将倍硫磷与功能单体在氯仿中4°C环境下预聚合，之后再加入交联剂和偶氮二异丁腈，并滴加至分散剂中，形成悬浮聚合体系，引发聚合，获得了粒度均匀的MIPs微球。传统的本体聚合法所制备的聚合物需要研磨、破碎和筛分等复杂的后处理工艺，所得颗粒为无定型颗粒，产率较低，这样做不仅费时费力，而且会破坏印迹识别位点和空间结构，使得聚合物的吸附容量、特异性、印迹和识别效率均有不同程度地降低。为了克服上述缺陷，本发明采用悬浮聚合法所制备MIPs的微球，省去了复杂的后处理工序，提高了产率，避免了印迹识别位点的人为破坏。由于微球的比表面积较无定形颗粒大，其吸附的速率较快，特异性吸附的容量也较大，这就使得基于微球的分子印迹固相萃取小柱具有更高的分离效率和更好的分离效果。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为本发明的实施例1中倍硫磷分子印迹固相萃取柱在蔬菜样品检测中回收率的测定结果图表；
图2为本发明的实施例2中倍硫磷分子印迹固相萃取柱在鸡肉样品检测中回收率的测定结果图表；
图3为本发明的实施例3中倍硫磷分子印迹固相萃取柱在猪肉样品检测中回收率的测定结果图表；

【具体实施方式】
[0016]以下是本发明的【具体实施方式】，下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0017]一种倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，包括以下步骤:
1)将模板分子溶于致孔剂中，然后加入功能单体，超声混匀5min，放入4°C冰箱进行预聚合24h，得到预聚合体系；
所述的模板分子为倍硫磷，致孔剂为氯仿，功能单体为甲基丙烯酸、4-乙烯基吡唆、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡唆、烯丙基胺、亚甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(双甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的一种或两种的组合；所述的模板分子与功能单体的比例为1:4-8，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为20mmol/L-70mmol/L ；
2)向步骤I)制得的预聚合体系中加入交联剂与引发剂，超声清洗仪中进行超声5min，混匀后通入氮气5min，然后在氮气气氛或真空状态下密封；
所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇双丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600)二甲基丙烯酸酯、马来松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇单酯、六亚甲基二异氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一种，加入量为功能单体的5倍，所述的引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异戊腈、偶氮二环己基甲腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的任意一种，加入量为步骤I)所加功能单体摩尔量的0.5-1.5倍；
3)按照分散剂与步骤I)所加功能单体比值为10mL/mmol-100mL/mmol的比例取一定量的分散剂置于四口烧瓶中；
所述的分散剂为，甘油、硅油或聚乙烯醇1788水溶液。其中聚乙烯醇1788水溶液配制时，先将聚乙烯醇1788加入蒸馏水中，加热至90°C _95°C使其溶解，形成6%_9%的聚乙烯醇1788溶液，冷却至室温，转至四口烧瓶中；
4)将2)所得的反应体系在搅拌和氮气保护下滴加入步骤3)的四口烧瓶中引发聚合，引发温度为45°C _65°C，聚合时间为8h-36h，得到微悬浮乳液，即为MIPs ；
5)将4)中的MIPs在丙酮中用湿筛法过筛，对颗粒大小进行分级，除去粒径较小和较大的微球，选出直径50μπι-70μπι的颗粒，用滤纸包好，用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液进行索氏抽提，期间进行取样，对索氏抽提液进行高效液相色谱分析，测定模板分子的含量，直至模板分子无法检出，停止索氏抽提；然后将得到的聚合物45°C烘干至恒重，得到对倍硫磷具有识别能力的MIPs微球；
6)称取5)中制备的MIPs100mg-200mg,用湿法填装固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮对柱子进行润洗，即得到倍硫磷分子印迹固相萃取小柱，然后封于锡箔袋中备用。
[0018]所述步骤3)中聚乙烯醇1788溶液的质量浓度为7%_8%。
[0019]所述步骤4)中的引发温度为50°C _60°C，聚合时间为12h_24h。
[0020]所述步骤4)中的搅拌速度为400r/min。
[0021]倍硫磷分子印迹固相萃取小柱用于食品中残留倍硫磷的选择性吸附和富集时，首先用3mL-7mL甲醇和3mL_7mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)润洗，2mL-7mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡，加入浓缩后的样品提取液lmL-5mL,经3mL_8mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)淋洗后，用5mL-10mL甲醇-乙酸混合液(9:1, v/v)洗脱。
[0022]实施例1
(一).倍硫磷MIPs的制备
称取7g聚乙烯醇1788加入到10mL蒸馏水中，于90°C _95°C的温度下溶解，冷却至室温，然后转入250mL的四口烧瓶中。准确称取Immol倍硫磷溶于15mL氯仿中，加入功能单体甲基丙烯酸4mmol，使其充分溶解，超声清洗仪中超声混匀5min，置于4°C冰箱进行预聚合24h，使其形成模板分子-功能单体预聚合体系。然后，向预聚合体系中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol，引发剂偶氮二异丁腈0.Smmol，超声混匀5min，在氮气保护下慢慢将其滴入上述四口烧瓶中，在400r/min转速下进行机械搅拌，水浴引发温度为60°C，引发聚合24h形成微悬浮乳液，所得微悬浮乳液在丙酮中用湿筛法过分级筛，选择直径为50 μ m- 70 μ m的颗粒，用定量滤纸包好，以体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液在索氏抽提器中进行模板分子的洗脱，期间定时取样，采用高效液相色谱法检测提取液中模板分子的含量，直至无模板分子出现时，停止抽提，将提取得到的物质于45°C烘干至恒重，即可得到模板分子的印迹聚合物微球(Molecular Imprinting Polymer, MIP)。
[0023]于本实施例中作为对照的空白分子印迹聚合物(Non-molecular ImprintingPolymer, NIP)的制备除不加模板分子，不进行预聚合外，其余步骤同上。
[0024](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征
静态平衡吸附量的测定，分别在1mL的塑料离心管中准确加入50mg的MIPs和5mL
0.5mmol/L倍硫磷的氯仿溶液，经旋涡后将其在摇床上振荡24h (摇床温度为25°C，转速为200r/min),然后以4000r/min的转速离心15min,取离心液ImL加氯仿稀释至10mL。用高效液相色谱法在模板分子的最大吸收波长处定点测定其平衡浓度。根据吸附前后溶液中模板分子浓度的变化，计算聚合物对模板分子的吸附量Qw，并平行测定三次取平均值。依式(I)计算NIP的静态平衡吸附量为0.026mmol/g, MIP的静态吸附量为0.072mmol/g。
[0025]Q = (C O',/ ⑴
Vws0 - sJ /m
式中Qw为静态平衡吸附量(mmol/g) ;(^为底物起始浓度(mmol/L) ;CS为吸附平衡时底物的浓度(mmol/L) ；V为底物溶液的体积(mL) ；m为MlP或NIP的加入量(mg)。
[0026]根据上述的测定结果计算MIPs的分离系数和印迹因子，用式(2)计算底物在聚合物和溶液两相中的分离系数K，结果表明，NIP的分离系数为0.35，MIP的分离系数为2.57。
[0027]K = Cp / ⑵
/tS:聚合物结合底物的浓度(ymol/g) ;CS:溶液中底物的平衡浓度(ymol/mL)。由式(3)计算MIPs的印迹因子I为7.32。
[0028]I =(3)
Kpmip =MIP的分离系数；Kpnip:NIP的分离系数。
[0029]将模板分子倍硫磷的氯仿溶液作为吸附液，在25°C下准确称取10份50mg的MIPs，测定它们对不同浓度的模板分子溶液的吸附量，以吸附量对模板分子浓度作图，绘制吸附等温曲线，将获得的数据用于式(4)Scatchard分析。再根据Scatchard曲线的斜率与截距求出MIPs的Qmax与Kd。结果显示MIP存在两类吸附位点，一类是具有高结合能和高选择性的结合位点，另一类是具有低结合能和低选择性的结合位点(其Kdi=0.30X 1^ymol/L，Qmaxl=2500.67 μ mol/g ；KD2=14.8 X 1-2 μ mol/L, Qmax2=5105.44ymol/g)0 而 NIP 仅有低结合能和低选择性的结合位点(Kd=3.3 X KT1 μ mol/L, Qmax=6104.34 μ mol/g)。
[0030]Scatcliard 方程:5 = _9l⑷
公式(4)中Kd表示结合位点的平衡解离常数，C表示模板分子的平衡浓度，Qfflax表示最大表观吸附量。
[0031](三).分子印迹固相萃取柱的制备
在一 3mL的固相萃取柱空柱管中放入下层筛板，将其放到固相萃取真空装置上，封堵空余的接口，打开真空泵，用3mL-5mL甲醇润洗，待用。准确称量倍硫磷MIP 200mg，用3mL异丙醇调制成混悬液，徐徐倒入预先准备得空白固相萃取小柱中，边加边轻轻敲打柱体，待匀浆液快抽干前放入上层的筛板并压紧。依次用1mL丙酮和1mL甲醇冲洗柱子，最后对其标记，放入锡箔袋中密封备用。
[0032](四).分子印迹固相萃取柱在蔬菜样品检测中回收率的测定
0.蔬菜中倍硫磷的提取
称取5g空白蔬菜样品，置于均质杯中，加入丙酮和石油醚各40mL，添加倍硫磷标准品，使其在样品中的浓度达到GB2763-2012中所规定的最大残留限量的0.5倍、I倍和2倍，而后于均质机上高速均质3min，上清液经过滤后，移入250mL分液漏斗中，加入150mL 20g/L硫酸钠水溶液，充分摇匀，静置分层，将下层溶液移入另一 250mL分液漏斗中，用40mL的石油醚萃取两次，合并石油醚层，过无水硫酸钠层，于旋转蒸发仪上蒸干，用ImL石油醚溶解残渣后备用。
[0033]2).蔬菜中倍硫磷的净化
分子印迹固相萃取柱首先用5mL甲醇和5mL甲醇-水溶液(1:9, v/v)依次润洗,3mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)平衡。加入浓缩后的样品提取液lmL，经4mL甲醇-水溶液(1: 9，v/V)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v) 6mL洗脱。洗脱液过0.22 μ m的有机膜后45°C减压蒸干，残渣用ImL的流动相定容，供高效液相色谱仪测定。
[0034]3).高效液相色谱法测定回收率
标准溶液的配制:用分析天平准确称取倍硫磷对照品，用甲醇溶解定容，分别配成浓度为 0.5 μ g/mL、1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL、10.0 μ g/mL、20.0 μ g/mL 和 40.0 μ g/mL 的标准工作液。每个浓度点做5个重复，共重复5天，做校正曲线。 色谱条件:色谱柱Agilent Zorbax SB C18, 250_X 4.6mm (1.d.),流动相甲醇-水(80:20, v/v)，检测波长250nm，进样量20yL，柱温为室温，流速lmL/min。经测定，其在蔬菜中的回收率见图表I所示(每个样品平行测定3次)。
[0035]实施例2
(一).倍硫磷MIPs的制备
制备的基本过程同实施例1，所用的分散剂为150mL的硅油，所用致孔剂用量为20mL，功能单体丙烯酰胺6mmol，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯30mmol，所述的引发剂为偶氮二异庚腈0.7mmol，引发聚合温度55°C，聚合时间12h，索氏萃取洗脱的时间15h。
[0036](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征
表征方法同实施例1，结果表明，NIP的静态平衡吸附量为0.022mmol/g, MIP的静态吸附量为0.048mmol/g, NIP的分离系数为0.28，MIP的分离系数为0.92，印迹因子I为3.27。在MIP上存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点(其 Kdi=0.42Xl(T2ymol/L，Qmaxl=2874.33 μ mol/g ;KD2=11.2X 1(Γ2 μ mol/L，Qmax2=4933.21 μ mol/g)。而NIP仅有低结合能和低选择性的结合位点(KD=5.2X ΙΟ—1 μ mol/L，Qmax=6833.51 μ mol/g)。(三).分子印迹固相萃取柱的制备
称取150mg的MIP装入3mL的固相萃取柱空柱管中，根据实施例1中的装柱方法制备分子印迹固相萃取柱，装好后依次用6mL丙酮和6mL甲醇润洗。最后对柱子标记，放入锡箔袋中密封待用。
[0037](四).分子印迹固相萃取柱在鸡肉样品检测中回收率的测定 I).鸡肉中倍硫磷的提取
称取匀浆后试样5g于50mL具塞离心管中，加入乙酸乙酯20mL，添加倍硫磷标准品，使其在样品中的浓度达到农业部235号公告中所规定的最大残留限量的0.5倍、I倍和2倍，润旋混勻Imin,振荡15min, 5000r/min离心1min,上清液转入鸡心瓶中，然后再加入乙酸乙酯1mL到具塞离心管中，重复提取一次，合并两次上清液，45°C水浴下旋转蒸发至近干。残留物用2mL乙腈-水溶液(1:1，v/v)溶解后备用。
[0038]2).鸡肉中倍硫磷的净化
分子印迹固相萃取柱首先用5mL甲醇和5mL甲醇水依次润洗，5mL乙腈-水溶液(1: 1，v/v)平衡。加入浓缩后的样品提取液lmL，经5mL甲醇-水溶液(1: 9，v/v)淋洗后，用甲醇-乙酸混合液(9:1，v/v) SmL洗脱。洗脱液过0.22 μ m的有机膜后45°C减压蒸干，残渣用ImL的流动相定容，供高效液相色谱仪测定。
[0039]3).高效液相色谱法测定回收率
采用高效液相色谱法对其回收率进行测定和计算(每个样品平行测定3次)，结果见图表2所示，所用色谱条件同实施例1。
[0040]实施例3
(一).倍硫磷MIPs的制备
制备的基本过程同实施例1，所用的分散剂为200mL的甘油，所用致孔剂用量为30mL，功能单体为4-乙烯基卩比唳7mmol,交联剂季戍四醇三丙烯酸酯35mmol,引发剂偶氮二异戍腈1.2mmol，引发聚合温度50°C，聚合时间18h，索氏萃取洗脱的时间24h。
[0041](二).倍硫磷MIPs吸附性能的表征表征方法同实施例1，结果表明，NIP的静态平衡吸附量为0.024mmol/g, MIP的静态吸附量为0.028mmol/g, NIP的分离系数为0.32，MIP的分离系数为0.39，印迹因子I为1.23。在MIP上存在两类吸附位点，一类是高选择性的结合位点，另一类是低选择性的结合位点(其 Km=0.54 X KT1 μ mol/L, Qmaxl=3144.42 μ mol/g ；Kd2=1.23 X KT1 μ mol/L,Qmax2=6548.34 μ mol/g)。而NIP仅有低结合能和低选择性的结合位点(KD=8.7X ΙΟ—1 μ mol/L, Qmax=9247.44 μ mol/g)。
[0042](三).分子印迹固相萃取柱的制备
称取180mg的MIP装入3mL的固相萃取柱空柱管中，根据实施例1中的装柱方法制备分子印迹固相萃取柱,依次用7mL丙酮和7mL甲醇润洗。然后对柱子标记,密封备用。
[0043](四).分子印迹固相萃取柱在猪肉样品检测中回收率的测定
样品的处理方法同实施例2，样品经过匀质后，添加倍硫磷标准品，使其在样品中的浓度达到农业部235号公告中所规定的最大残留限量的0.5倍、I倍和2倍，而后采用实施例2中的方法进行样品的提取和净化，用高效液相色谱法对其回收率进行测定和计算(每个样品平行测定3次)，结果见图表3所示，所用色谱条件同实施例1。
【权利要求】
1.倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于，制备步骤为: 1)将模板分子溶解于致孔剂中，加入功能单体，超声处理5min混匀，放入4°C冰箱进行预聚合24h，得到预聚合体系； 所述的模板分子为倍硫磷；所述的致孔剂为氯仿；所述的功能单体为甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、1-乙烯基咪唑、2-乙烯基吡啶、烯丙基胺、亚甲基丁二酸、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基咪唑、N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、4-乙烯嘧啶、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯和2-(双甲基胺)乙基甲基丙烯酸酯中的任意一种或两种的组合；所述的模板分子和功能单体的摩尔比为1:4-8，模板分子在致孔剂中的摩尔浓度为 20mmol/L_ 70mmol/L ； 2)向步骤I)制得的预聚合体系中加入交联剂和引发剂，超声处理5min，充分混合后，通入氮气5min，并在氮气气氛或真空状态下密封； 所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙二醇双丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(400) 二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇(600) 二甲基丙烯酸酯、马来松香丙烯酸乙二醇酯、(2-甲基丙烯酰胺)乙氧基-2-甲基丙烯酸乙二醇单酯、六亚甲基二异氰酸酯和四乙氧基硅烷中的任意一种，交联剂的加入量为步骤I)所加功能单体摩尔量的5倍； 所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异戊腈、偶氮二环己基甲腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的任意一种，加入量为步骤I)所加功能单体摩尔量的0.5-1.5倍； 3)按照分散剂与步骤I)所加功能单体比值为lOmL/mmol-lOOmL/mmol的比例取一定量的分散剂置于四口烧瓶中； 所述的分散剂为甘油、娃油或聚乙烯醇水溶液。
2.其中聚乙烯醇水溶液配制时，先将聚乙烯醇加入蒸馏水中，加热至90°C?95°C使其溶解，制得质量浓度为6%-9%的聚乙烯醇溶液，冷却至室温，即完成制备； 4)将步骤2)所得的反应体系在搅拌和氮气保护下滴加入步骤3)的四口烧瓶中引发聚合，引发温度为45°C _65°C,聚合时间为8h-36h,得到微悬浮乳液，即为印迹聚合物； 5)将步骤4)得到的印迹聚合物在丙酮中用湿筛法过分级筛，筛选出直径为50 μ m-70 μ m的颗粒，并用滤纸包好,采用体积比为9:1的甲醇-乙酸混合溶液进行索氏抽提，期间定时对新流出的提取液进行取样，并采用高效液相色谱分析取样得到的提取液中倍硫磷的含量，直至提取液中无倍硫磷时停止索氏提取，然后，将滤纸中剩余的物质在45°C烘干至恒重，得到微球状的对倍硫磷具有识别能力的分子印迹聚合物； 6)称取步骤5)所制备的分子印迹聚合物100mg-200mg,用湿法填装固相萃取柱,依次用甲醇和丙酮对柱子进行润洗，然后封于锡箔袋中，即得到倍硫磷分子印迹固相萃取小柱。
3.根据权利要求1所述的倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中聚乙烯醇溶液的质量浓度为7%-8%。
4.根据权利要求1所述的倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中的引发温度为50°C _60°C，聚合时间为12h-24h。
5.根据权利要求1所述的倍硫磷分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中的搅拌速度为400r/min。
6.根据权利要求1所述方法制备的倍硫磷分子印迹固相萃取小柱在食品残留倍硫磷的选择性吸附和富集中的应用。
【文档编号】G01N30/08GK104209103SQ201410362441
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】李兆周, 李道敏, 张小帆, 侯玉泽, 高红丽, 曹力, 陈秀金, 李松彪, 吕璞, 张成博, 张腊梅, 雍雪萍, 俞嘉伟, 王爽 申请人:河南科技大学