一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法
【专利摘要】本发明公开一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，包括菌悬液的制备及样品处理、杀菌检测和显色判定，当阳性血清对照组为阳性结果，阴性血清对照组、补体空白对照组和细菌活性对照组均为阴性结果时，待检血清显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即不具有杀菌活性；待检血清不显色或出现片状沉淀为阳性结果，即具有杀菌活性。本发明方法无需采用肉眼逐一进行活菌计数，仅通过显色或不显色就可直观、快速地判定待检血清是否具有杀菌活性，每块微孔板同时设立各照为检测结果成立的条件，其检测步骤简便、快速、可靠准确。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌性疫苗免疫动物或者健康人群后，产生的血清抗体具有功能性杀 菌或抑菌活性评价【技术领域】。 一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法 技术背景
[0002] 血清抗体杀菌力检测，可以衡量一个特定物种的免疫球蛋白的功能特性。血清抗 体杀菌力检测依赖抗体识别条件，通过经典途径激活，使表面暴露的抗原与补体、抗体结 合，导致抑菌或溶菌。现有的血清抗体杀菌力检测，其步骤及结果判定方法复杂，特别是需 要人的肉眼直接进行活菌计数，误差较大，试验耗时长，且适用范围有限。以下以流脑血清 抗体杀菌力试验为例说明其现有血清抗体杀菌力检测方法具体操作：
[0003] 1、菌悬液制备
[0004] 启开菌种，于固体培养基上复苏培养后，接种于液体培养基中扩增培养。菌液稀释 制成均匀的菌悬液。取菌悬液于波长为540nm的分光光度计上测其光密度值，再稀释至所 需的最终浓度（例如：4000个菌落形成单位/毫升）。
[0005] 2、杀菌抗体检测 [0006] 2. 1待检血清稀释
[0007] 先在微孔板每孔内加25 μ 1稀释液。用移液器从每排第一孔内加25 μ 1经56°C、 30min灭活的待检血清，吹吸5?10次后吸出25 μ 1至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后 一孔。
[0008] 2. 2杀菌反应
[0009] 每孔中加入12. 5μ 1补体，再加入稀释好的菌悬液12. 5μ 1，振荡器上中速振荡5 分钟后，于37 °C培养25分钟，再振荡5分钟。
[0010] 2. 3杀菌后显色培养
[0011] 每孔加 50μ 1已熔化冷至45°C左右的TTC琼脂后，微孔板置37°C条件培养15? 20小时后观察结果。
[0012] 3、结果判定
[0013] 3.1对照设置
[0014] 阳性参考血清对照；4孔补体对照（稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌 活性）；4孔细菌生长对照（稀释液、灭活补体和靶菌菌液各12. 5 μ 1)。每次检测时至少每 5块微孔板中应有一组上述三种对照试验。
[0015] 3. 2活菌计数判定结果
[0016] 3· 2· 1菌悬液空白对照检验
[0017] 各孔滴完菌悬液之后，将该菌悬液两滴分别滴加到一个琼脂平皿的一端，沿着划 好的两条线倾斜下流，于37°C与微孔板同时培养，次日检查每滴菌悬液的菌落数及其纯度。
[0018] 3. 2. 2检查三种对照设置的结果：
[0019] 补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落；阳性参考血清应达 到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现 红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；如果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或 更多时，则判断为杀菌阴性。
[0020] 3. 2. 3杀菌结果判定标准
[0021] 通过人的肉眼观察并一个一个逐一地计算菌落个数（活菌计数），根据红色点状 菌落数目的多少，以符号" + "记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长 时，应出现众多红色点状菌落，可记为"++++"。当所试各孔与其比较，菌落数减少30%以 下，记为"+++";减少50%左右记为减少70%左右记为" + " ;每孔少于10个菌落则记 为"土"。以细菌生长成呈" + "及以下者判断为杀菌阳性；以"++"及以上者判为杀菌阴性。 以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。
[0022] 因此，现有血清抗体杀菌力检测结果判定需通过肉眼观察计数菌落的活菌计数的 方式，获得待检血清组及生长对照组的活菌数并进行比较，若待检血清组活菌数相对于生 长对照组减少70%则判为阳性。由于微孔板上视野差，肉眼观察计数菌落错误率高，经常出 现漏计或重复计数的情况，结果误差较大，工作量大、繁琐复杂。若菌悬液浓度过高，菌落在 微小的孔内密集生长呈片状菌苔，观察不到单一的菌落，导致无法对杀菌检测结果予以判 定。
【发明内容】
[0023] 本发明要解决的技术问题是克服现有血清抗体杀菌力检测方法存在需通过肉眼 观察计数菌落，经常出现漏计或重复计数的情况，计数错误率高，结果误差较大，工作量大、 繁琐复杂的缺陷。其目的是开发一种步骤简单，结果直观易于分辨，判定方法可靠的补体 介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法（Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity Test, CMAB)〇
[0024] 本发明的方法是用抗原（疫苗或菌体）免疫试验动物（包括品系小鼠、家兔、恒河 猴）或健康人群，获得免疫后的特异性血清，再将特异性血清抗体、补体（与免疫动物非同 源）和检测菌按顺序混合后反应，选择合适的活菌显色剂区分具有活性的菌体和死菌，使 得实验者可快速直观的对试验结果进行判定。
[0025] 本发明所提供的技术方案如下：
[0026] 1. 一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，包括以下步骤：
[0027] (1)菌悬液的制备及样品处理
[0028] ①菌悬液制备
[0029] 在琼脂固体培养基斜面上复苏菌种，接种至液体培养基中扩增培养得到菌液，按 照比浊法确定菌液的浓度，用生理盐水将菌液稀释成工作浓度即得菌悬液；
[0030] ②试剂准备
[0031] 显色剂配制成质量体积分数为〇. 1 %?3 %的显色剂溶液，将显色剂溶液过滤除 菌，于2?8°C避光保存；
[0032] ③样品处理
[0033] 补体为与免疫动物非同源的动物血清、阴性血清为免疫动物注射生理盐水的血 清，阳性血清为市售的目标菌的诊断血清，补体稀释至5?10倍，阳性血清和阴性血清分别 稀释至原倍?10倍，将稀释5?10倍的补体与菌悬液按体积比为1:1?1:2的比例混合 后冰浴静置2?30分钟得到活化菌悬液；
[0034] (2)杀菌检测
[0035] ①加样稀释
[0036] 取待检血清加至无菌微孔板的样品孔中，用生理盐水进行倍倍稀释；阳性对照样 品孔、阴性对照样品孔中分别加入稀释至原倍?10倍的阳性血清和稀释至原倍?10倍的 阴性血清；补体空白对照孔和细菌活性对照孔分别加入液体培养基，每个对照重复三孔；
[0037] ②杀菌反应
[0038] 除细菌活性对照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步骤（1)③所述的活化菌悬 液，细菌活性对照孔中加入步骤（1)①所述的菌悬液，然后将微孔板于37°C条件孵育1?8 小时，再在微孔板的每个孔中加入37°C预热的培养基，再孵育1?12小时；
[0039] (3)显色判定
[0040] ①显色，在微孔板的每个孔中均加入步骤（1)②所配制的显色剂溶液后，于37°C 孵育0. 5?6小时显色；或将微孔板于2?8°C静置过夜，在微孔板的每个孔中均加入步骤 (1)②所配制的显色剂溶液，于37°C孵育0. 5?6小时显色；
[0041] ②判定
[0042] 显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即不具有杀菌活性，不显色或出现片状沉淀 的为阳性结果，即具有杀菌活性；当阳性血清对照组为阳性结果，阴性血清对照组、补体空 白对照组和细菌活性对照组均为阴性结果时，待检血清显色或出现针尖状沉淀为阴性结 果，即不具有杀菌活性；待检血清不显色或出现片状沉淀为阳性结果，即具有杀菌活性。
[0043] 2.根据技术方案1所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：步骤（1)①菌悬液制备所复苏的菌种为伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌属、大肠埃希菌 属、溶血性弧菌属或痢疾志贺氏菌。
[0044] 3.根据技术方案2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：
[0045] 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为伤寒沙门菌时，所述的琼脂固体培养基和液体 培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基，所述的工作浓度为 10X105 ?10X108/ml ;
[0046] 步骤⑴②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑；
[0047] 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤⑵② 杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后 的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入 的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔 加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空 白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中 的缓冲蛋白胨水培养基；
[0048] 步骤（2)②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，，细菌活性对照孔 中加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的 用量为样品孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中 国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基；
[0049] 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的 量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
[0050] 4.根据技术方案2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：
[0051] 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为副伤寒沙门菌属时，所述的琼脂固体培养基和液 体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基，所述的工作浓度 为 10X105 ?10X108/ml ;
[0052] 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑；
[0053] 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)② 杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后 的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入 的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔 加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空 白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中 的缓冲蛋白胨水培养基；
[0054] 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中 加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用 量为样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基 为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基；
[0055] 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤⑴②所配制的显色剂溶液的 量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
[0056] 5.根据技术方案2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：
[0057] 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为大肠埃希菌属时，所述的琼脂固体培养基和液 体培养基均为中国国家标准GB 4789. 38-2012中的EC肉汤培养基，所述的工作浓度为 8X105/ml ?8X108/ml ;
[0058] 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑；
[0059] 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)② 杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后 的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入 的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔 加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空 白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB 4789. 38-2012 中的EC肉汤培养基；
[0060] 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中 加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用 量为样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基 为中国国家标准GB 4789. 38-2012中的EC肉汤培养基；
[0061] 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤⑴②所配制的显色剂溶液的 量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
[0062] 6.根据技术方案2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：
[0063] 步骤⑴①菌悬液制备中菌种为溶血性弧菌属时，所述的琼脂固体培养基和液体 培养基均为中国国家标准GB 4789. 7- 2013中的3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基，所述的 工作浓度为 18X105/ml ?18X108/ml ;
[0064] 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫；
[0065] 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)② 杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后 的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入 的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔 加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空 白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB 4789. 7- 2013 中的3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基；
[0066] 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中 加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用 量为样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基 为中国国家标准GB 4789. 7-2013中的3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基；
[0067] 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤⑴②所配制的显色剂溶液的 量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
[0068] 7.根据技术方案2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特 征在于：
[0069] 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为痢疾志贺氏菌时，所述的琼脂固体培养基和液体 培养基均为中国国家标准GB4789. 5- 2012中的志贺氏菌增菌肉汤培养基，所述的工作浓 度为 8 X 105/ml ?8 X 108/ml ;
[0070] 步骤⑴②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑；
[0071] 步骤⑵①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤⑵② 杀菌反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后 的待检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入 的阴性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔 加入的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空 白对照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 5- 2012中 的志贺氏菌增菌肉汤培养基；
[0072] 步骤（2)②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中 加入的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用 量为样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基 为中国国家标准GB4789. 5- 2012中的志贺氏菌增菌肉汤培养基；
[0073] 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的 量与样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
[0074] 与现有技术相比，本发明方法的有益效果是：
[0075] 1、本发明方法提出了一种新的技术方案，无需现有技术采用肉眼逐一进行活菌计 数的方法，仅通过显色或不显色就可直观、快速地判定待检血清是否具有杀菌活性，其检测 步骤简便、快速、可靠准确，克服了现有技术用肉眼活菌计数经常易出现漏计或重复计数、 计数错误率高，结果误差较大，工作量大、繁琐复杂的缺陷。
[0076] 2、本发明方法在每块微孔板同时设立了阳性对照、阴性对照、补体空白对照孔、细 菌活性对照，并以各对照为应有的结果为检测结果成立的条件，检测结果以各对照为验证， 使本发明方法的检测结果可靠准确。
【专利附图】
【附图说明】
[0077] 图1是本发明补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法检测显色后结果 示例。
【具体实施方式】
[0078] 通过以下实例进一步说明本发明。本发明并不局限于实施例，实例仅为本发明解 决案例之一。
[0079] 以下各实施例无特殊说明为常用方法。所用疫苗均由云南沃森生物技术股份有限 公司提供，也可向该公司购买，该公司地址：云南省昆明高新技术开发区北区科发路云南省 大学科技园，邮政编码650106。
[0080] 实施例1甲型副伤寒结合疫苗免疫小鼠血清杀菌抗体检测
[0081] 1菌悬液的制备及样品处理
[0082] 1. 1菌悬液制备
[0083] 在琼脂培养基斜面上复苏甲型副伤寒菌株，37°C培养22小时，用接种环挑取适量 菌苔接种于液体培养基中，37°C摇育18小时，将菌液用生理盐水比浊稀释至10X10 7/ml即 得菌悬液，所述的琼脂固体培养基和液体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的 缓冲蛋白胨水培养基。
[0084] 1. 2试剂准备
[0085] 显色剂用生理盐水配制成0. 1% (W/V)的显色剂溶液，除菌过滤，2?8°C避光保 存，所述的显色剂为四氮唑紫。96孔板的灭菌：96孔板放入75%乙醇中浸泡15分钟，紫外 灯下照射30分钟（或使用商品化的已灭菌96孔板）。
[0086] 1.3样品处理
[0087] 补体为健康的实验用豚鼠血清，用生理盐水将补体做5倍稀释；阴性血清为健康 小鼠注射生理盐水后获得的血清，阳性血清为市售的沙门氏菌属0:2因子诊断血清，阴性 血清和阳性血清分别用生理盐水做10倍稀释。将稀释5倍的补体与10X 107/ml的菌悬液 等体积混合，冰浴中静置20分钟得到活化菌悬液。
[0088] 2杀菌检测
[0089] 2. 1加样稀释
[0090] ①取各待检血清样品20μ 1分别加至1#?14#组样品孔的第1孔中，用60μ 1生 理盐水做4倍稀释，然后从1#?14#组样品孔的第1孔中取40 μ 1稀释后待检血清至第2 孔中，用40 μ 1生理盐水做倍倍稀释，如此做倍倍稀释至第6孔（稀释倍数见表1)，样品孔 每孔中倍倍稀释后的待检血清体积均为40 μ 1，样品孔每孔中倍倍稀释后的待检血清体积 与步骤2. 2杀菌反应中①所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1。
[0091] ②阳性对照样品孔加入10倍稀释阳性血清40μ 1，重复三孔；阴性对照样品孔加 入10倍稀释阴性血清40 μ 1，重复三孔；补体空白对照孔加入液体培养基40 μ 1，重复三孔； 细菌活性对照孔加入40 μ 1液体培养基，重复三孔。补体空白对照孔和细菌活性对照孔加 入的液体培养基均为国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基。
[0092] 2. 2杀囷反应
[0093] ①除细菌活性对照孔外，96孔板的其余各孔分别加入步骤1. 3所述的活化菌悬液 各20 μ 1 (与倍倍稀释后的待检血清体积比为1:2)。细菌活性对照孔的每孔加入5 X 107/ ml的菌悬液（不含补体）20 μ 1。加样及稀释倍数见表1。
[0094] ②96孔板于37°C条件孵育2小时，再在96孔板的每个孔中加入37°C预热的培养 基100 μ 1 (即样品孔每孔中倍倍稀释后的待检血清体积40 μ 1的2. 5倍），再孵育3小时。 所述的37°C预热的培养基为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基。
[0095] 表1.血清样品稀释表
[0096]
【权利要求】
1. 一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，包括以下步骤： (1) 菌悬液的制备及样品处理 ① 菌悬液制备 在琼脂固体培养基斜面上复苏菌种，接种至液体培养基中扩增培养得到菌液，按照比 浊法确定菌液的工作浓度，用生理盐水将菌液稀释成工作浓度即得菌悬液； ② 试剂准备 显色剂配制成质量体积分数为〇. 1 %?3 %的显色剂溶液，将显色剂溶液过滤除菌，于 2?8°C避光保存； ③ 样品处理 补体为与免疫动物非同源的动物血清、阴性血清为免疫动物注射生理盐水的血清，阳 性血清为市售的目标菌的诊断血清，补体稀释至5?10倍，阳性血清和阴性血清分别稀释 至原倍?10倍，将稀释5?10倍的补体与菌悬液按体积比为1:1?1:2的比例混合后冰 浴静置2?30分钟得到活化菌悬液； (2) 杀菌检测 ① 加样稀释 取待检血清加至无菌微孔板的样品孔中，用生理盐水进行倍倍稀释；阳性对照样品孔、 阴性对照样品孔中分别加入稀释至原倍?10倍的阳性血清和稀释至原倍?10倍的阴性血 清；补体空白对照孔和细菌活性对照孔分别加入液体培养基，每个对照重复三孔； ② 杀菌反应 除细菌活性对照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步骤（1)③所述的活化菌悬液，细 菌活性对照孔中加入步骤（1)①所述的菌悬液，然后将微孔板于37°C条件孵育1?8小时， 再在微孔板的每个孔中加入37°C预热的培养基，再孵育1?12小时； (3) 显色判定 ① 显色，在微孔板的每个孔中均加入步骤（1)②所配制的显色剂溶液后，于37°C孵育 0. 5?6小时显色；或将微孔板于2?8°C静置过夜，在微孔板的每个孔中均加入步骤（1)② 所配制的显色剂溶液，于37°C孵育0. 5?6小时显色； ② 判定 显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即不具有杀菌活性，不显色或出现片状沉淀的为 阳性结果，即具有杀菌活性；当阳性血清对照组为阳性结果，阴性血清对照组、补体空白对 照组和细菌活性对照组均为阴性结果时，待检血清显色或出现针尖状沉淀为阴性结果，即 不具有杀菌活性；待检血清不显色或出现片状沉淀为阳性结果，即具有杀菌活性。
2. 根据权利要求1所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于：步骤（1)①菌悬液制备所复苏的菌种为伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌属、大肠埃希菌属、 溶血性弧菌属或痢疾志贺氏菌。
3. 根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于： 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为伤寒沙门菌时，所述的琼脂固体培养基和液体培 养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基，所述的工作浓度为 10X105 ?10X108/ml ; 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑； 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)②杀菌 反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待 检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴 性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入 的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对 照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓 冲蛋白胨水培养基； 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中加入 的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用量为 样品孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中国国家 标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基； 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的量与 样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
4. 根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于： 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为副伤寒沙门菌属时，所述的琼脂固体培养基和液体 培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基，所述的工作浓度为 10X105 ?10X108/ml ; 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑； 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)②杀菌 反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待 检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴 性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入 的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对 照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓 冲蛋白胨水培养基； 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中加入 的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用量为 样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中 国国家标准GB4789. 4- 2010中的缓冲蛋白胨水培养基； 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的量与 样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
5. 根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于： 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为大肠埃希菌属时，所述的琼脂固体培养基和液体培养 基均为中国国家标准GB 4789. 38-2012中的EC肉汤培养基，所述的工作浓度为8 X105/ ml ?8 X 108/ml ; 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑； 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)②杀菌 反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待 检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴 性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入 的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对 照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB 4789. 38-2012中的 EC肉汤培养基； 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中加入 的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用量为 样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中 国国家标准GB 4789. 38-2012中的EC肉汤培养基； 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的量与 样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
6. 根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于： 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为溶血性弧菌属时，所述的琼脂固体培养基和液体培养 基均为中国国家标准GB 4789. 7- 2013中的3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基，所述的工作 浓度为 18X 105/ml ?18X 108/ml ; 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫； 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)②杀菌 反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待 检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴 性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入 的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对 照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB 4789. 7- 2013中的 3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基； 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中加入 的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用量为 样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中 国国家标准GB 4789. 7-2013中的3%氯化钠胰蛋白胨大豆培养基； 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的量与 样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
7. 根据权利要求2所述的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法，其特征在 于： 步骤（1)①菌悬液制备中菌种为痢疾志贺氏菌时，所述的琼脂固体培养基和液体培养 基均为中国国家标准GB4789. 5- 2012中的志贺氏菌增菌肉汤培养基，所述的工作浓度为 8X105/ml ?8X108/ml ; 步骤（1)②试剂准备中所述的显色剂为四氮唑紫或新四氮唑； 步骤（2)①加样稀释中样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积与步骤（2)②杀菌 反应中所述的活化菌悬液体积的体积比为2:1?4:1，且样品孔的每孔中倍倍稀释后的待 检血清体积均相等，阳性对照孔的每孔加入的阳性血清的量、阴性对照孔的每孔加入的阴 性血清的量、补体空白对照孔的每孔加入的液体培养基的量和细菌活性对照孔的每孔加入 的液体培养基的量均与样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清的用量等体积，补体空白对 照孔和细菌活性对照孔分别加入的液体培养基均为中国国家标准GB4789. 5- 2012中的志 贺氏菌增菌肉汤培养基； 步骤⑵②杀菌反应中所述活化菌悬液体积为20 μ 1?40 μ 1，细菌活性对照孔中加入 的菌悬液的量与活化菌悬液等体积，微孔板的每个孔中加入的37°C预热的培养基的用量为 样品孔的每孔中倍倍稀释后的待检血清体积的2. 5?3倍，所述的37°C预热的培养基为中 国国家标准GB4789. 5- 2012中的志贺氏菌增菌肉汤培养基； 步骤（3)①显色中在微孔板的每个孔中加入的步骤（1)②所配制的显色剂溶液的量与 样品孔中倍倍稀释后的待检血清等体积。
【文档编号】G01N21/78GK104101596SQ201410362470
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】李生迪, 吴俊波, 赵志宏, 白梅, 马波, 张梦菲 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司