一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒；所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2，所述试剂R1包含的各组分为：缓冲液、β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；所述试剂R2包含的各组分为：缓冲液、还原型辅酶I(NADH)、3α-羟基类固醇、表面活性剂、抗氧化酶、稳定剂、防腐剂。本发明在试剂中加入抗氧化酶，使NADH能长时间保存，去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响，使得NADH更高效的利用，提高了循环反应的速度，使得检测的精准度提高，灵敏度更高，线性范围更广，同时可以减少主要反应物料的用量，减少了试剂的成本。
【专利说明】一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体地，涉及一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]正常人肝脏合成的胆汁酸有胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和代谢中产生的脱氧胆酸(DCA)还有少量石胆酸(LCA)和微量熊脱氧胆酸(UDCA)，合称总胆汁酸(TBA)。
[0003]人体血清总胆汁酸(TBA)是由肝脏合成并分解代谢，从而维持人体胆汁酸的相对稳定，它的调控是肝脏的一个主要功能。当肝细胞发生病变或患胆管疾病时可引起胆汁的代谢障碍，使进入血中的胆汁酸含量显著升高，血清TBA升高与肝细胞损伤程度成正比。
[0004]胆汁酸是胆固醇在肝脏分解代谢的产物，胆汁是由肝脏分泌到胆汁中，并随胆汁排入肠腔，作用于脂肪的消化吸收。胆汁酸在肠腔经细菌作用后，95%以上的胆汁酸被肠壁吸收经门静脉血重返肝脏利用，称为胆汁酸肠——肝循环。故正常人血中胆汁酸浓度很低。胆汁酸的生成和代谢与肝脏有十分密切的关系，一旦当肝细胞发生病变，血清TBA很容易升高，因而血清TBA水平是反映肝实质损伤的一项重要指标。
[0005]各类肝胆疾病的TBA升高:急性肝炎与肝癌均为100%，肝硬化为87.5%，慢性肝炎、胆道疾病也达65%以上。说明了肝胆疾病中TBA测定比传统肝功能指标任何一项都敏感。
[0006]急性肝炎与慢性肝炎的TBA有差异:急性肝炎时患者血清TBA与丙氨酸转氨基酶(ALT) 一样，呈显著增高，平均增高幅度是正常的31倍，说明TBA对急性肝炎早期诊断价值与ALT(阳性率100% )测定相同，经积极治疗后随肝细胞损害的控制很快转为正常，而TBA则随肝功能的恢复逐渐转为正常。慢性肝炎时，TBA阳性率为65.7%，平均升高幅度为正常的10倍。
[0007]肝癌、肝硬化时，由于肝脏对TBA代谢功能下降，故血清TBA在不同阶段都增高。当肝癌时，TBA阳性率为100%，而肝硬化TBA阳性率为88%，亦高于其他指标。当转氨酶、胆红素及碱性磷酸酶等其他指标转为正常情况下，血清中TBA水平仍很高，这可能由于肝细胞功能失调，肝实质细胞减少等原因有关。
[0008]胆汁酸不但参与脂质的消化吸收，同时可维持胆汁中胆固醇的可溶性状态，当胆汁酸代谢导致胆固醇性胆石的形成，胆石形成阻塞加重胆汁酸的代谢异常，其阳性率明显高于其他肝功能指标。血清中TBA水平显著增高，随炎症的阻塞阶段不同而变化，但随着炎症消失或阻塞引流解除后，TBA水平迅速下降，其他指标亦随之正常。由此可见，TBA测定是一个良好的肝功能指标，能反映肝实质损伤的一项重要指征。
[0009]诊断方法:胆汁酸作为从胆固醇转化形成的类固醇，其分子上3 α -羟基对3 α -羟类固醇脱氢酶(3 a -HSD)的酶催化作用比较敏感，胆汁酸C3上α位的羟基在3 a -HSD的作用下脱氢形成羰基，此酶促反应的辅酶是氧化型辅酶I (NAD+)，反应后NAD+作为受氢体转化成还原型辅酶I (NADH)。根据这一酶法反应的原理发展出几种可以适合临床实验室进行胆汁酸分析的方法。1974年挪威科明公司采用纯制的3 α -羟基类固醇成功的生产出第一代酶法胆汁酸试剂，使胆汁酸的测定真正进入临床领域，到现今，胆汁酸的检测已经发展到了第5代循环酶法。此法的反应体系中引入辅酶I的一种硫代衍生物，其反应原理如下:胆汁酸被3α-羟类固醇脱氢酶(3C1-HSD)氧化，生成3-酮类固醇，脱下的氢被Th1-NAD接受，使Th1-NAD转化为Th1-NADH ;同时在反应体系中还存在NADH时，3 a -HSD又催化逆向反应，使正反应生成的3-酮类固醇又氧化成为胆汁酸，完成一个循环。经如此反复循环的酶反应，Th1-NADH的生成量不断增大，在一定时间内，酶循环产生的β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Th1-NADH)量与样品中胆汁酸浓度成正比。Th1-NADH在395nm~415nm波长处有光吸收峰，可在自动生化分析仪器内连续监测410nm的吸光度变化，求得胆汁酸的浓度。
[0010]但是，上述测定方法还存在着问题，由于NADH在溶液中很难长时间的保存，使得试剂稳定性差，保存时间短。而NADH又是循环反应中主要的物质，NADH含量的变化对试剂检测性能的影响非常大。
【发明内容】
[0011]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒。本发明对胆汁酸检测的第5代循环酶法加以改进，通过加入抗氧化酶，使NADH能长时间保存，提高试剂稳定性。同时加入抗氧化酶后，去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响，使得NADH更高效的利用，提高循环反应的速度，使得检测灵敏度更高，线性范围更广。
[0012]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0013]本发明涉及一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂Rl及试剂R2，
[0014]所述试剂Rl包括的各组分及浓度为:
[0015]
【权利要求】
1.一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂Rl及试剂R2， 所述试剂Rl包括的各组分及浓度为:
所述试剂R2包括的各组分及浓度为:
2.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述Rl中的缓冲液的pH为3.0~5.0。
3.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、磷酸缓冲液、GOODS缓冲液中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl中的表面活性剂为吐温20、吐温80、Brij35、曲拉通-100中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇或螯合剂EDTA。
6.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl中的防腐剂为叠氮钠或proclin300。
7.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液的pH为8.0~10.0。
8.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液为GOODS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、AMPSO缓冲液中的一种或几种。
9.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇或螯合剂EDTA ;所述防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
10.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的抗氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽中的一种或几种。
【文档编号】G01N33/53GK104198420SQ201410401471
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】李伟奇, 李 杰, 房君江, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司