用于鉴定军团菌毒力的方法及其专用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定军团菌毒力的方法及其专用试剂盒。本发明的方法包括如下步骤：(1)设置参数：Spectral?acquisition?setup；Grating?scan?type:Extended；Confocality:Standard；Spectrum?Range:Low?100.00；Centre?Raman?shit/cm-1；High?2000.00；Configuration:Laser?name?532nm?edge；Grating?name?1800l/mm；Exposure?time/s:10.00；Accumulations:1；Objective:50；Laser?power％:100；(2)进行检测；(3)得到拉曼光谱图；在500-2000横坐标范围内：如果存在1个以上强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。本发明提供的方法快速、简便、检测成本低。
【专利说明】用于鉴定军团菌毒力的方法及其专用试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于鉴定军团菌毒力的方法及其专用试剂盒。
【背景技术】
[0002]军团菌，系需氧革兰氏阴性杆菌，以嗜肺军团菌最易致病。军团菌属已有48个军团菌种被发现，其中19种被认为与人类呼吸道感染有关。
[0003]流行病学调查证实，军团菌是通过气溶胶经空气传播给人的，与冷却塔、热水供应系统、蒸汽浓缩器、矿泉疗养浴池、临床呼吸装置的加湿器、超级市场蔬菜喷雾器、喷泉等有关。个别报道，引用被军团菌污染的水和接触被军团菌污染的土壤也能引起军团病。目前为止，人与人之间的传播尚未得到证实。军团病的特征为肺炎伴全身性毒血症症状，严重者出现周围回圈衰竭、呼吸衰竭。胸部X线表现在早期为单叶斑片状阴影，继而肺实变，病变迅速发展至多肺叶段，可有肺脓肿形成或少量胸腔积液征。确诊依赖于特异性抗体的检查及在痰、胸腔积液、肺组织活检标本中分离出细菌。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于鉴定军团菌毒力的方法及其专用试剂盒。
[0005]本发明提供了一种鉴定待测军团菌的毒力的试剂盒，包括拉曼光谱仪和记载有如下操作规程的载体:
[0006](I)设置拉曼光谱仪的如下参数:
[0007]关键参数为:Spectralacquisit1n setup ；
[0008]在Range界面设置如下参数:
[0009]Grating scan type:Extended ;
[0010]Confocality: Standard ；
[0011]Spectrum Range: Low 100.00;
[0012]Centre Raman shit/cnT1 ；
[0013]High 2000.00 ；
[0014]Configurat1n: Laser name 532nm edge ；
[0015]Grating name 1800 1/mm ；
[0016]在Acquisit1n界面设置如下参数:
[0017]Exposure time/s: 10.00 ；
[0018]Accumulat1ns:1 ；
[0019]Objective:50 ；
[0020]Laser power %: 100 ；
[0021](2)取待测军团菌置于载玻片上，放置到完成步骤(I)的参数设置的拉曼光谱仪中进行检测；
[0022](3)完成步骤(2)后，将拉曼光谱仪的自带软件设置为WiRE3.0，进行数据处理，得到拉曼光谱图；拉曼光谱图中，在500-2000横坐标范围内:如果存在I个以上(含I个)纵坐标(counts)强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0023]本发明还保护一种鉴定待测军团菌的毒力的方法，包括如下步骤:
[0024](I)设置拉曼光谱仪的如下参数:
[0025]关键参数为:Spectralacquisit1n setup ；
[0026]在Range界面设置如下参数:
[0027]Grating scan type:Extended ;
[0028]Confocality: Standard ；
[0029]Spectrum Range: Low 100.00;
[0030]Centre Raman shit/cm"1 ；
[0031]High 2000.00 ；
[0032]Configurat1n: Laser name 532nm edge ；
[0033]Grating name 1800 1/mm ；
[0034]在Acquisit1n界面设置如下参数:
[0035]Exposure time/s: 10.00 ；
[0036]Accumulat1ns:1 ；
[0037]Objective:50 ；
[0038]Laser power %: 100 ；
[0039](2)取待测军团菌置于载玻片上，放置到完成步骤(I)的参数设置的拉曼光谱仪中进行检测；
[0040](3)完成步骤(2)后，将拉曼光谱仪的自带软件设置为WiRE3.0，进行数据处理，得到拉曼光谱图；拉曼光谱图中，在500-2000横坐标范围内:如果存在I个以上(含I个)纵坐标(counts)强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0041]所述拉曼光谱仪具体可为生产厂家为英国雷尼绍公司(RENISHAW)，型号为inViaRaman Microscope的拉曼光谱仪。
[0042]军团菌强毒株和军团菌弱毒株的定义如下:将待测军团菌与宿主细胞共培养，如果与共培养的O时刻相比，共培养24小时后宿主细胞内的所述待测军团菌数量增加，待测军团菌为军团菌强度株；如果不满足上述条件，待测军团菌为军团菌弱毒株。所述宿主细胞具体可为小鼠肺泡巨噬细胞系J774。
[0043]军团菌强毒株和军团菌弱毒株的定义具体如下:(I)取待测军团菌，用PBS缓冲液(pH7.2-7.4,0.01M)悬浮，得到108cfu/ml的菌悬液，然后用RPMI1640培养液将菌悬液稀释至10倍体积，得到浓度为107cfu/ml的菌液；(2)采用含10% (体积比)胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮小鼠肺泡巨噬细胞系J774，得到细胞浓度为2 X 15个细胞/mL的细胞悬液；(3)取24孔板，每孔加入500 μ L步骤(2)得到的细胞悬液，置于37°C、5% CO2环境中培养4小时；然后加入放入Iml步骤(I)得到的菌液，置于37°C、5% CO2环境中培养
1.5小时；然后取出24孔板，用PBS缓冲液清洗三遍以去除非粘附细菌；然后每孔加入I毫升RPMI1640培养液，置于37°C、5% CO2环境中共培养，分别于共培养O小时或24小时后弃除培养上清，每孔加入ImL灭菌水，刮下孔底部的细胞，并将此细胞混悬液转移至1.5mL的离心管，梯度稀释之后接种于BCYE平板，进行军团菌的菌落计数；如果与共培养的O时刻相比，共培养24小时后每毫升细胞混悬液中军团菌的数量增加，待测军团菌为军团菌强度株；如果不满足上述条件，待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0044]军团菌强毒株和军团菌弱毒株的定义具体如下:取5只以上BALB/c小鼠，通过气管吸入的方式，每只BALB/c小鼠吸入40 μ I菌含量为18Cfu的待测军团菌的菌悬液以进行攻毒，攻毒后的第3天，如果小鼠的死亡率为100%、待测军团菌为军团菌强毒株，如果60%以上小鼠具有军团菌感染的发病表征且60%以下小鼠死亡、待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0045]本发明提供的方法，快速、简便、需要样品量极少、检测成本低，能够鉴定军团菌致病力强弱，减小杂散光和背景辐射所产生的噪声对测量的影响，提高测量准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为实施例1的步骤一的结果图。
[0047]图2为实施例1的步骤二的结果图。
[0048]图3为对比例I的结果图。
[0049]图4为对比例2的结果图。
[0050]图5为实施例2的步骤二的结果图。
[0051]图6为实施例2的步骤三的结果图。
【具体实施方式】
[0052]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ACES的全称为2-乙酰基-2-氨基乙烷磺酸。
[0053]GVPC培养基:甘氨酸3g/L、多粘菌素B硫酸盐80000IU/L、万古霉素盐酸盐0.001g/L、放线菌酮0.08g/L、酵母浸出物(细菌级)10.0g、琼脂12.0g、活性炭2.0g、α -酮戊二酸1.0g、ACES 10.0g, KOH 2.8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.4g、焦磷酸铁0.6g，蒸馏水补充至 100mL, il pH 值至 7.0±0.2。
[0054]BCYE培养基:酵母浸出物(细菌级)10.0g、琼脂12.0g、活性炭2.0g、α -酮戊二酸1.0g, ACES 10.0g, KOH 2.8g、L-半胱氨酸盐酸盐0.4g、焦磷酸铁0.6g，蒸馏水补充至100mL, il pH 值至 6.9。
[0055]BCYE-cys培养基:酵母浸出物(细菌级)10.0g、琼脂12.0g、活性炭2.0g、α -酮戊二酸1.0g、ACES10.0g、K0H 2.8g、焦磷酸铁0.6g，蒸馏水补充至100mL,调pH值至6.9。
[0056]小鼠肺泡巨噬细胞系J774:购自上海基免实业有限公司，货号为细胞系J774。
[0057]BALB/c小鼠:北京维通利华实验动物技术有限公司，产品货号BALB/c，7周龄。
[0058]实施例中所使用的拉曼光谱仪的生产厂家为英国雷尼绍公司(RENISHAW)，型号为inVia Raman Microscope。
[0059]军团菌是胞内寄生菌。将待测军团菌与宿主细胞共培养，如果与共培养的O时刻相比，共培养24小时后宿主细胞内的所述待测军团菌数量增加，待测军团菌为军团菌强度株；如果不满足上述条件，待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0060]实施例1、采用本发明的方法对现有菌株的毒力进行比较
[0061]军团菌ATCC33152，即 ATCC 中编号为 33152 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.pneumophila Brenner et al.),强毒株。
[0062]军团菌ATCC33156,即 ATCC 中编号为 33156 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.fraseri Brenner et al.),强毒株。
[0063]军团菌ATCC43878 即 ATCC 中编号为 43878 的军团菌(Leg1nella brunensisWilkinson et al.)，弱毒株。
[0064]军团菌ATCC35249 即 ATCC 中编号为 35249 的军团菌(Leg1nella spiritensisBrenner et al.)，弱毒株。
[0065]军团菌ATCC35252 即 ATCC 中编号为 35252 的军团菌(Leg1nella cherriiBrenner et al),弱毒株。
[0066]军团菌ATCC35304 即 ATCC 中编号为 35304 的军团菌(Leg1nella rubriIucensBrenner et al.)，弱毒株。
[0067]将以上6株菌分别作为待测菌株进行如下操作:
[0068]一、获取拉曼光谱图
[0069]1、将待测菌株接种至BCYE培养基，37°C、110rpm振荡培养18小时，然后4°C、8000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀。
[0070]2、设置拉曼光谱仪的如下参数:
[0071]关键参数为:Spectralacquisit1n setup ；
[0072]在Range界面设置如下参数:
[0073]Grating scan type:Extended ;
[0074]Confocality: Standard ；
[0075]Spectrum Range: Low 100.00;
[0076]Centre Raman shit/cnT1 ；
[0077]High 2000.00 ；
[0078]Configurat1n: Laser name 532nm edge ；
[0079]Grating name 1800 1/mm ；
[0080]在Acquisit1n界面设置如下参数:
[0081]Exposure time/s:10.00 ；
[0082]Accumulat1ns:1 ；
[0083]Objective:50 ；
[0084]Laser power %:100。
[0085]3、将取少量步骤I得到的菌体沉淀置于载玻片上，放置到完成步骤2的参数设置的拉曼光谱仪中进行检测。
[0086]4、完成步骤3后，将拉曼光谱仪的自带软件设置为WiRE3.0，进行数据处理，得到拉曼光谱图。
[0087]6个待测菌株的拉曼光谱见图1。根据6个待测菌株的拉曼光谱图确定如下判断标准:在500-2000横坐标(Raman shift/cnT1)范围内:如果存在I个以上(含I个)纵坐标(counts)强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。
[0088]二、通过细胞实验验证各个菌株的毒力
[0089]1、将待测菌株划线接种至BCYE培养基平板，置于37°C、5% CO2环境中培养48小时。
[0090]2、完成步骤I后，刮取平板上的菌，用PBS缓冲液(pH7.2-7.4、0.01M)悬浮，得到108cfu/ml的菌悬液，然后用RPMI1640培养液将菌悬液稀释至10倍体积，得到浓度为107cfu/ml 的菌液。
[0091]3、采用含10% (体积比)胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮小鼠肺泡巨噬细胞系J774，得到细胞浓度为2 X 15个细胞/mL的细胞悬液。
[0092]4、取24孔板，每孔加入500 μ L步骤3得到的细胞悬液，置于37°C、5% C02环境中培养4小时；然后加入放入Iml步骤2得到的菌液，置于37°C、5% CO2环境中培养1.5小时；然后取出24孔板，用PBS缓冲液清洗三遍以去除非粘附细菌；然后每孔加入I毫升RPMI1640培养液，置于37°C、5% CO2环境中培养，分别于培养O小时、24小时，48小时或72小时后弃除培养上清，每孔加入ImL灭菌水，用橡胶细胞刮，刮下孔底部的细胞，并将此细胞混悬液转移至1.5mL的离心管，梯度稀释之后接种于BCYE平板，进行军团菌的菌落计数。
[0093]结果见图2 (三次重复实验的平均值)，纵坐标为每毫升细胞混悬液中军团菌的数量。
[0094]三、通过动物实验验证各个现有菌株的毒力
[0095]将BALB/c小鼠分为7组，每组10只，分别进行如下攻毒处理:
[0096]第一组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC33152的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0097]第二组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC33156的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)；
[0098]第三组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC43878的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0099]第四组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC35249的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0100]第五组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC35252的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0101]第六组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I军团菌ATCC35304的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0102]第七组(空白对照组):通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40μ I生理盐水喷雾液。
[0103]攻毒后的第3天，统计每组发病小鼠的只数以及死亡情况。发病表征如下:反应迟缓且全身发抖且精神萎靡且运动不畅且伴有高热症状。
[0104]第一组具有发病表征的小鼠为10只(10只均死亡)，第二组具有发病表征的小鼠为10只(10只均死亡)，第三组具有发病表征的小鼠为8只(没有死亡小鼠)，第四组具有发病表征的小鼠为8只(没有死亡小鼠)，第五组具有发病表征的小鼠为7只(其中I只死亡)，第六组具有发病表征的小鼠为9只(没有死亡小鼠)，第七组均没有发病表征。
[0105]对比例1、
[0106]军团菌ATCC33152，即 ATCC 中编号为 33152 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.pneumophila Brenner et al.),强毒株。
[0107]军团菌ATCC33156,即 ATCC 中编号为 33156 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.fraseri Brenner et al.),强毒株。
[0108]军团菌ATCC43878 即 ATCC 中编号为 43878 的军团菌(Leg1nella brunensisWilkinson et al.)，弱毒株。
[0109]军团菌ATCC35249 即 ATCC 中编号为 35249 的军团菌(Leg1nella spiritensisBrenner et al.)，弱毒株。
[0110]将以上4株菌分别作为待测菌株进行如下操作:
[0111]1、将待测菌株接种至BCYE培养基，37°C、110rpm振荡培养18小时，然后4°C、8000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀。
[0112]2、设置拉曼光谱仪的如下参数:
[0113]Configurat1n: Laser name 1320nm edge ；
[0114]其它各个参数均同实施例1的步骤一的2中的参数。
[0115]4个待测菌株的拉曼光谱见图3。
[0116]对比例2、
[0117]军团菌ATCC33152，即 ATCC 中编号为 33152 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.pneumophila Brenner et al.),强毒株。
[0118]军团菌ATCC33156,即 ATCC 中编号为 33156 的军团菌(Leg1nella pneumophilasubsp.fraseri Brenner et al.),强毒株。
[0119]军团菌ATCC43878 即 ATCC 中编号为 43878 的军团菌(Leg1nella brunensisWilkinson et al.)，弱毒株。
[0120]军团菌ATCC35249 即 ATCC 中编号为 35249 的军团菌(Leg1nella spiritensisBrenner et al.)，弱毒株。
[0121]将以上4株菌分别作为待测菌株进行如下操作:
[0122]1、将待测菌株接种至BCYE培养基，37°C、110rpm振荡培养18小时，然后4°C、8000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀。
[0123]2、设置拉曼光谱仪的如下参数:
[0124]Exposure time/s: 100.00 ；
[0125]其它各个参数均同实施例1的步骤一的2中的参数。
[0126]4个待测菌株的拉曼光谱见图4。
[0127]实施例2、采用本发明的方法对采集的菌株的毒力进行比较
[0128]一、采集菌株
[0129]2014年3月，从北京市的下水道采集水样。
[0130]从水样中分离军团菌的方法如下:
[0131]1、将水样涂布于GVPC培养基平板，置于35°C、2.5% CO2培养箱中培养48小时。
[0132]2、完成步骤I后，挑取平板上的菌落，采用BCYE培养基平板，置于35°C、2.5% CO2培养箱中培养，采用稀释平板分离法，得到纯菌株。
[0133]3、将步骤2得到的各个纯菌株分别进行形态鉴定，满足如下形态特征的为候选的军团菌(军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，需每天在体式镜上观察):菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状；在紫外灯下有荧光。
[0134]4、将步骤3得到的各个候选的军团菌分别进行如下验证:接种待测菌株分别接种到BCYE培养基平板和BCYE-cys培养基，置于35°C、2.5% CO2培养箱中培养2天，如果待测菌株在BCYE培养基平板上生长而在BCYE-cys培养基平板上不生长，该菌株为候选的军团菌。
[0135]5、将步骤4的得到的各个候选的军团菌分别进行进一步验证，如果满足如下条件，该菌株为军团菌:氧化酶(一 /弱+)，硝酸盐还原一，尿素酶一，明胶液化+，水解马尿酸。共获得3株军团菌。
[0136]二、获取菌株的拉曼光谱图
[0137]同实施例1的步骤一。
[0138]步骤一得到的3株军团菌的拉曼光谱图见图5。毒株I和毒株2为军团菌强毒株，毒株3为军团菌弱毒株。
[0139]三、通过细胞实验验证各个现有菌株的毒力
[0140]方法同实施例1的步骤二。
[0141]步骤一得到的3株军团菌的毒力见图6。毒株I和毒株2为军团菌强毒株，毒株3为军团菌弱毒株。
[0142]四、通过动物实验验证各个现有菌株的毒力
[0143]将BALB/c小鼠分为7组，每组10只，分别进行如下攻毒处理:
[0144]第一组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I毒株I的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0145]第二组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I毒株2的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0146]第三组:通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40 μ I毒株3的菌悬液(其中军团菌菌含量为18Cfu)以攻毒；
[0147]第四组(空白对照组):通过气管吸入的方式，每只小鼠吸入40μ I生理盐水喷雾液。
[0148]攻毒后的第3天，统计每组发病小鼠的只数以及死亡情况。发病表征如下:反应迟缓且全身发抖且精神萎靡且运动不畅且伴有高热症状。
[0149]第一组具有发病表征的小鼠为10只(10只均死亡)，第二组具有发病表征的小鼠为10只(10只均死亡)，第三组具有发病表征的小鼠为7只(没有死亡小鼠)，第四组均没有发病表征。
【权利要求】
1.一种鉴定待测军团菌的毒力的试剂盒，包括拉曼光谱仪和记载有如下操作规程的载体: (1)设置拉曼光谱仪的如下参数: 关键参数为:Spectral acquisit1n setup ； 在Range界面设置如下参数:
Grating scan type:Extended ;
Confocality: Standard ；
Spectrum Range: Low 100.00 ；
Centre Raman shit/cm1;
High 2000.00 ；
Configurat1n: Laser name 532nm edge ；
Grating name 1800 1/mm ； 在Acquisit1n界面设置如下参数:
Exposure time/s:10.00 ；
Accumulat1ns:1 ；
Objective:50 ；
Laser power %: 100 ； (2)取待测军团菌置于载玻片上，放置到完成步骤(I)的参数设置的拉曼光谱仪中进行检测； (3)完成步骤(2)后，将拉曼光谱仪的自带软件设置为WiRE3.0，进行数据处理，得到拉曼光谱图；拉曼光谱图中，在500-2000横坐标范围内:如果存在I个以上纵坐标强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。
2.一种鉴定待测军团菌的毒力的方法，包括如下步骤: (I)设置拉曼光谱仪的如下参数: 关键参数为:Spectral acquisit1n setup ； 在Range界面设置如下参数:
Grating scan type:Extended ;
Confocality: Standard ；
Spectrum Range: Low 100.00 ；
Centre Raman shit/cm1;
High 2000.00 ；
Configurat1n: Laser name 532nm edge ；
Grating name 1800 1/mm ； 在Acquisit1n界面设置如下参数:
Exposure time/s:10.00 ；
Accumulat1ns:1 ；
Objective:50 ；
Laser power %: 100 ； (2)取待测军团菌置于载玻片上，放置到完成步骤(I)的参数设置的拉曼光谱仪中进行检测； (3)完成步骤(2)后，将拉曼光谱仪的自带软件设置为WiRE3.0，进行数据处理，得到拉曼光谱图；拉曼光谱图中，在500-2000横坐标范围内:如果存在I个以上纵坐标强度为4000以上的峰，该待测军团菌为军团菌强毒株；如果不满足上述条件，该待测军团菌为军团菌弱毒株。
【文档编号】G01N21/65GK104165879SQ201410409558
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】刘文军, 李晶, 秦天, 任红宇, 贾潇潇, 周海健, 邵祝军, 杨利敏 申请人:中国科学院微生物研究所, 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所