一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和MetabolomicsXCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱，将待鉴定霉菌采用同样方法获得指纹图谱；然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而初步鉴定其为同一株菌株，通过筛选产毒真菌的培养条件，有机溶剂提取净化，高效液相色谱高分辨质谱检测，以非靶向代谢检测技术为手段，以靶向代谢检测为基础，具有检测成本低、分析毒素速度快、建立的指纹图谱可以简捷辨别该类产毒真菌，重现性好的优点。
【专利说明】一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴 定霉菌菌种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种曲霉菌代谢物的检测和分类方法，具体地说，涉及一种利用霉菌 代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，属于食品安全检测和分类
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 曲霉菌霉菌是自然界分布较普遍的腐生菌类之一，几乎无处不在，曲霉属的许多 囷种引起谷物、食品、词料和制品等的霉腐变质，一些曲霉囷霉囷在特定条件下能广生次级 代谢产物真菌毒素，目前已发现的真菌毒素大约有400多种，是粮食中有害物质的重要来 源，这些产毒真菌代谢产物可污染原料、饲料，进而污染食品，动物，进入人类食品链；真菌 毒素不仅能导致食品腐败变质、营养损失及品质降低，还具有致癌、致畸、致突变和免疫抑 制毒性，影响生长发育等不良效应。随着生活质量的提高，为保障食品安全，加强粮食及其 食品中的真菌毒素的监测已经成为国内外学者研究的热点。
[0003] 目前，曲霉菌霉菌的分类一般采用传统的形态学特征结合生理生化性状的分类方 法，并长期占据着主要地位。近年来，为了寻求产毒曲霉菌霉菌的快速诊断技术及更加准 确、快捷的分类方法，产毒曲霉菌霉菌的分类、系统发育以及疑难种的鉴定已普遍应用遗 传学、生物化学、分子生物学领域的相关技术。但后来证实，这些分类特征的分类价值被估 计过高。多数曲霉菌霉菌形态特征不稳定。有些种具有形态可变性或交叉性。分子鉴定技 术比形态学分类有优越性，但也存在其局限性。如分子杂交技术是对基因组DNA酶切后 杂交，杂交量大，结果不易分析；AFLP虽是非常有效的分子标记技术，但是操作要求 严格；RAPD极易受反应条件的影响，不同条件下的结果难以重复等。同时，曲霉菌的存 在是产生有毒代谢物的条件，但有曲霉菌污染并不一定会带来曲霉菌毒素污染，比如黄曲 霉有产霉毒素的菌株和不产毒素菌株，不产毒素菌株被用来作为有益菌对产毒菌株加以抑 制，但二者从分类学和分子生物学的角度比较，差异非常小，但如果从食品安全角度，产毒 与不产毒菌株完全是两个概念；曲霉菌代谢产物在一定条件下也可以相互进行转化，近来 国外有研究表明，杂色曲霉毒素在合适条件下可以转化成黄曲霉毒素。目前，曲霉菌的检测 和分类与真菌毒素的检测从生物学和化学的两个领域被严格区分开来，各自被独立进行研 究，忽视了其内在的必然联系和规律。从经济价值比较，分子鉴定技术对技术人员要求高， 提取过程复杂，使用试剂昂贵，检测周期长。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的问题是针对以上不足，提供一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱 的方法，本发明利用高分辨质谱技术，通过对产毒曲霉菌代谢产物的分析，建立其相关的指 纹图谱，对曲霉菌种类鉴定提供了一种新方法，具有检测成本低、分析毒素速度快、重现性 好的优点。
[0005] 本发明的另一目的是利用指纹图谱鉴定未知霉菌菌种的方法，简单、成本低、针对 性强。
[0006] 为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种利用霉菌代谢产物建立 指纹图谱的方法，其特征在于：所述方法为将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌 代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到霉菌标志性代谢 产物和其指纹图谱。
[0007] 利用本发明可以快速准确的建立代谢物指纹图谱，并利用指纹谱库对其进行分类 鉴定。
[0008] -种优化方案，所述方法包括霉菌代谢产物的培养步骤： 将霉菌接种到PDA液体培养基，摇床培养，然后将得到的菌种接种到无菌的含有PDA固 体培养基的培养皿中，涂布均匀培养，PDA固体培养基内含有山梨酸。
[0009] PDA固体培养基成分简单，有利于代谢物的提取纯化，可以减少质谱检测基质的干 扰。在培养代谢产物的过程中，发明人偶然发现在PDA固体培养基中添加山梨酸可以诱导 黄曲霉毒素代谢物的产生。
[0010] 进一步地，山梨酸占 PDA固体培养基重量的0. 07%。
[0011] 发明人经过大量试验，发现在PDA固体培养基中添加山梨酸的含量低于0. 07%作 用不明显，含量高于0. 07%会产生抑制效果，0. 07%时效果最好。
[0012] 进一步地，所述方法还包括高分辨质谱检测步骤： 培养至15天、20天、30天时，分别按照以下步骤操作： (1)取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容， 经滤膜过滤，得到样品c; 取装有PDA固体培养基的无菌平板，重复以上步骤得对照样品，以kb表示；（2)将样品 c和kb在HPLC/T0F-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次，得到样品c和kb 的三个全扫描数据。
[0013] 进一步地，所述样品的数量为三个，第一个样品用乙酸乙酯和甲醇提取；第二个样 品用水和乙腈提取；第三个样品用乙酸乙酯和叔丁醇提取；然后混合均匀。
[0014] 通过不同极性溶剂的提取，可以最大程度地提取代谢产物，离心分离过膜后直接 上质谱检测，可以减少代谢物提取损失。通过高效液相色谱梯度洗脱，在减少检测时间的同 时能够较好的分离代谢产物。因为本发明的目的是根据黄曲霉毒素建立霉菌代谢产物标志 代谢产物和其指纹图谱，不是检测和建立其所有标志性代谢产物，由于黄曲霉毒素在正离 子条件下响应值高，所以只是做了正离子全扫描，荷质比范围为50-500,能够达到本发明的 要求，减少了分析时间。
[0015] 进一步地，所述方法还包括Metabolomics XCMS分析步骤： 将九个样品扫描数据做为实验组，九个对照样品扫描数据做为对照组，使用 Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数 据分析，得到霉菌的详细代谢物信息。
[0016] 采用Metabolomics XCMS分析，可以快速对质谱的数据进行分析归类，提取代谢物 详细信息，最大程度地节约人工分析时间。
[0017] 进一步地，所述方法还包括： 根据霉菌的详细代谢物信息，利用统计学指标fold-change、pvalue、tstat确定实验 组与对照组显著性差异，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。
[0018] 利用统计学指标分析，排除仪器误差，基质干扰，不同培养阶段产生的不同化合 物，即找出其稳定的标志性代谢产物和其指纹图谱。
[0019] 进一步地，所述方法还包括： 按照以上步骤建立已知霉菌菌株的代谢物指纹图谱，从而建立起一套完整的菌种代谢 物数据库。
[0020] 基于以上代谢物数据库，同样可以根据本发明建立未知霉菌的标志性代谢产物从 而对其分类鉴定，其特征在于：所述方法将待鉴定霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌 代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到待鉴定霉菌标志 性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱； 然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性 代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而初步鉴定其为 同一株菌株。
[0021] 能够简单、快速的以代谢产物对曲霉菌进行检测分类鉴定，非常有针对性，弥补了 分子生物学分类的不足。
[0022] -种优化方案，所述方法包括权利要求2-5任一项的方法。
[0023] 本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：通过筛选产毒真菌的 培养条件，有机溶剂提取净化，高效液相色谱高分辨质谱检测，以非靶向代谢检测技术为手 段，以靶向代谢检测为基础，具有检测成本低、分析毒素速度快、建立的指纹图谱可以简捷 辨别该类产毒真菌，重现性好的优点。
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 附图1为本发明实施例中8-Hydroxycarteolol的EIC图； 附图2为本发明实施例中8-Hydroxycarteolol的spec图； 附图3为本发明实施例中2-〇_Feruloyltartronic acid的EIC图； 附图4为本发明实施例中2-〇_Feruloyltartronic acid的spec图； 附图5为本发明实施例中Lactaronecatorin A的EIC图； 附图6为本发明实施例中Lactaronecatorin A的spec图； 附图7为本发明实施例中Benzyl b-L-arabinopyranoside的EIC图； 附图8为本发明实施例中Benzyl b-L-arabinopyranoside的spec图； 附图9为本发明实施例中Mansonone C的EIC图； 附图10为本发明实施例中Mansonone C的spec图； 附图11为本发明实施例中Aflatoxin B1的EIC图； 附图12为本发明实施例中Aflatoxin B1的spec图； 附图13为本发明实施例中RITA的EIC图； 附图14为本发明实施例中RITA的spec图； 附图15为本发明实施例中N-Undecylbenzenesulfonic acid的EIC图； 附图16为本发明实施例中N-Undecylbenzenesulfonic acid的spec图； 附图17为本发明实施例中Kojic acid的EIC图； 附图18为本发明实施例中Kojic acid的spec图； 附图19为本发明实施例中Triphasiol的EIC图； 附图20为本发明实施例中Triphasiol的spec图； 附图21为本发明实施例中Ethylsuberenol的EIC图； 附图22为本发明实施例中Ethylsuberenol的spec图； 附图23为本发明实施例中Ala His Tyr的EIC图； 附图24为本发明实施例中Ala His Tyr的spec图； 附图 25 为本发明实施例中 2-〇-p_Coumaroylhydroxycitric acid 的 EIC 图； 附图 26 为本发明实施例中 2-〇-p_Coumaroylhydroxycitric acid 的 spec 图； 附图27为本发明实施例中Linusitamarin的EIC图； 附图28为本发明实施例中Linusitamarin的spec图。
【具体实施方式】
[0026] 以寄生曲霉菌（3. 6156)为例进行详细说明建立指纹图谱的方法，该方法是一种通 用方法，不局限于寄生曲霉菌（3. 6156)。
[0027] 实施例1，一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，包括霉菌代谢产物的培养 步骤、高分辨质谱检测步骤、Metabolomics XCMS分析步骤，将已知霉菌经PDA固体培养基 培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到 霉菌标志性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱。
[0028] 霉菌代谢产物的培养步骤： 将冷藏的寄生曲霉菌（3. 6156)接种到PDA液体培养基，28°C摇床培养3天，然后将得 到的菌种接种到无菌的含有PDA固体培养基的培养皿中，涂布均匀，在25°C下培养，PDA固 体培养基内含有山梨酸，山梨酸占 PDA固体培养基重量的0. 07%。
[0029] 高分辨质谱检测步骤，采用高效液相色谱高分辨质谱联用仪，英文简写HPLC/ T0F-MS ： 培养至15天时，按照以下步骤操作： (1) 取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容， 经滤膜过滤，得到样品c，本实施例中样品的数量为三个； 具体步骤为：使用打孔器垂直切下三个直径8mm包含真菌菌丝体和其下培养基的柱状 样品，将样品转移至5mL的一次性离心管中，第一个样品用2 mL乙酸乙酯和2 mL甲醇提 取；第二个样品用2 mL水和2 mL乙腈提取，第三个样品用2 mL乙酸乙酯和2 mL叔丁醇提 取，各涡混1 min后超声lh，15000r/min离心17分钟，将三个样品离心上清液合样后氮气 吹干，用lml乙腈水（3:7,含0. 1%甲酸）溶液定容，经0. 22 μ m的滤膜过滤，得到样品c ; 同时以装有PDA固体培养基的无菌平板做空白对照，重复以上步骤得对照样品，以kb 表不； (2) 将样品c和kb在HPLC/T0F-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次， 各得到样品c和kb的三个全扫描数据； HPLC的检测条件如下： 反相C18柱，流动相：A 0. 1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱程序：0 - 1. Omin，5%B ; 1. Ο - 6. Omin, 5%B - 30%B; 6. Ο - 11. Omin, 30%B - 60%B ; 11. Ο - 16. Omin, 60%B - 98%B ; 16. 0 - 18. 0min，98%B ;平衡 2. Omin ; TOF-MS的质谱参数如下： Scanning Scope :50-500 ; Gas Temp: 350° C ; Drying Gas: 12L/min ； Nebulizer: 45psig ； Ion Polarity: Positive ； Date Storage: Centroid。
[0030] 继续培养至20天时，取出重复步骤（1)和步骤（2)的操作，得到样品c和kb的三 个全扫描数据； 继续培养至30天时，取出重复步骤（1)和步骤（2)的操作，得到样品c和kb的三个全 扫描数据。
[0031] Metabolomics XCMS 分析步骤： 将九个样品扫描数据做为实验组，九个空白对照扫描数据做为对照组，使用 Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数 据分析，得到寄生曲霉菌（3. 6156)的详细代谢物信息。
[0032] 通过Metabolomics XCMS软件处理，得到5249个特征离子，利用统计学指标 fold_change、pvalue、tstat等进一步分析确定实验组与对照组显著性差异，确定506个特 征离子，最后经质谱图分析，筛选出14个标志性代谢产物，寄生曲霉菌（3. 6156)菌种标志 性代谢产物指纹图谱数据见表1-5。
[0033] 表 1
【权利要求】
1. 一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，其特征在于：所述方法为将已知 霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和 Metabolomics XCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括霉菌代谢产物的培养步骤： 将霉菌接种到PDA液体培养基，摇床培养，然后将得到的菌种接种到无菌的含有PDA固 体培养基的培养皿中，涂布均匀培养，PDA固体培养基内含有山梨酸。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述山梨酸占 PDA固体培养基重量的 0· 07%。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括高分辨质谱检测步骤： 培养至15天、20天、30天时，分别按照以下步骤操作： (1) 取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容， 经滤膜过滤，得到样品c; 取装有PDA固体培养基的无菌平板，重复以上步骤得对照样品，以kb表示； (2) 将样品c和kb在HPLC/TOF-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次， 得到样品c和kb的三个全扫描数据。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述样品的数量为三个，第一个样品用乙酸 乙酯和甲醇提取；第二个样品用水和乙腈提取；第三个样品用乙酸乙酯和叔丁醇提取；然 后混合均匀。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括Metabolomics XCMS分析 步骤： 将九个样品扫描数据做为实验组，九个对照样品扫描数据做为对照组，使用 Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数 据分析，得到霉菌的详细代谢物信息。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括： 根据霉菌的详细代谢物信息，利用统计学指标fold-change、pvalue、tstat确定实验 组与对照组显著性差异，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括： 按照以上步骤建立已知霉菌菌株的指纹图谱，从而建立起一套完整的菌种代谢物数据 库。
9. 一种利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，其特征在于：所述方法将待鉴定霉菌经 PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到待鉴定霉菌标志性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱； 然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性 代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而鉴定其为同一 株菌株。
10. 如权利要求9所述利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，其特征在于：所述方法包括 权利要求2-5任一项的方法。
【文档编号】G01N30/02GK104142375SQ201410409664
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】宫小明, 孙军, 郭礼强, 刘永强, 丁葵英, 田国宁, 赵晗, 郝莹 申请人:中华人民共和国潍坊出入境检验检疫局