一种抗OmpC抗体检测试纸的制备方法及用途

一种抗OmpC抗体检测试纸的制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种抗OmpC抗体检测试纸、制备方法及应用。该试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上。本发明采用间接免疫检测法，用OmpC抗原蛋白，实现对样本中抗OmpC抗体的高灵敏度、高特异性快速检测，为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病的辅助诊断提供依据。
【专利说明】-种抗OmpC抗体检测试纸的制备方法及用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测抗OmpC抗体的免 疫层析检测试纸的制备方法及应用。

【背景技术】
[0002] 炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因尚不十分清楚的 慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃瘍性结肠炎（ulcerative colitis, UC)和克罗恩病 (Crohn's disease，CD)。克罗恩病于 1932 年由 Crohn、Ginzterg 和 Oppenheime 最早描述， 故得此名。本病又曾被称为"局限性肠炎"、"节段性肠炎"、"慢性肠壁全层炎"等。1973年， 世界卫生组织医学科学国际组织委员会将本病定名为Crohn病。其特点为病因未明，多见 于青年人，表现为肉芽肿性炎症病变，合并纤维化与溃疡。可侵及全胃肠道的任何部位，包 括口腔、肛门，病变呈节段性或跳跃性分布，并可侵及肠道以外，特别是皮肤。临床表现因病 变部位、范围及程度不同而多样化，病程缓慢，易复发。
[0003] IBD是北美和欧洲的常见病，近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高趋势，我国虽 尚无普通人群的流行病学资料，但近10多年来本病就诊人数呈逐步增加趋势则非常明显。 IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便 血等非特异性肠炎表现，CD与UC，以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊 断。
[0004] 目前鉴别IBD与其他慢性肠道炎症的生物标志物主要集中在自身免疫抗体与抗 微生物抗体。大肠杆菌是人体肠道内的正常细菌之一，一般情况下不致病。但在某些特殊 情况下，当机体对大肠杆菌的某种蛋白过激反应时，可发生腹痛、腹泻等肠炎症状。研究表 明，IBD与机体对大肠杆菌外膜孔道蛋白C (Outer membrane protein C，OmpC)的过激反应 有关，大约有50%的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗体比正常人高2倍以上，因此，通过检测 血清中抗OmpC的IgA抗体可以辅助诊断IBD。
[0005] 发明专利"一种抗体检测试剂盒（OmpC-IgA) "（申请号201310062278. 7)首次公 布了用化学发光检测试剂盒实现对抗OmpC的IgA抗体检测。本发明用胶体金/彩色胶乳 标记制备的免疫层析试纸条，使检测更为简便，并且能同时检测IgG和IgA两种抗体。
[0006] 免疫层析法（immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其 原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的纤维 素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至 固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检 测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等， 其中以纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。
[0007] 以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，GICT)。胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血 酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定 的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢 固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质 结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物 理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而 使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0008] 表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂，与胶体金技术一 样，彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优 点。彩色胶乳标记是将不同直径范围〇. lum-lum彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯 类或其他大分子物质共价结合，使这些大分子标记上颜色，当在检测线或质控线上富集停 留后形成肉眼可见的彩色条带。
[0009] 与现有技术ELISA和化学发光法相比，免疫层析法检测的优点主要包括：（1)使用 方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在20分钟内完成；（2)成本低，不需要特 殊的仪器设备；(3)应用范围广，可适应多种检测条件；(4)可以进行多项检测，同时能检测 IgG和IgA抗体，多项检测可以节省样品，降低成本；（5)标记物稳定，标记样品在4°C贮存 两年年以上，无信号衰减现象；(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标 的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
[0010] 在自体免疫性疾病诊断方面，已出现较多的免疫层析试纸，但基于抗OmpC抗体检 测的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问世。


【发明内容】

[0011] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到抗 OmpC抗体的检测中，通过把OmpC抗原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品 中抗OmpC抗体的高特异、高灵敏度、高准确性的检测，快速筛查抗OmpC抗体阳性标本，为临 床UC等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊断。
[0012] 本发明的目的之一在于提供一种快速、准确的抗OmpC抗体的免疫层析检测试纸 条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗OmpC抗体检测方法。
[0013] 作为本发明第一个方面的一种抗OmpC抗体的免疫层析检测试纸条，包括样品垫 (1) 、结合垫（2)、分析膜（3)、吸水垫（6)和底板（7)，分析膜（3)上设置检测带（4)和质控 带（5)，所述底板（7)的上部贴合有分析膜（3)，分析膜（3)上部的两端分别贴合有结合垫 (2) 和吸水垫（6)，结合垫（2)上部的一端贴合有样品垫（1)。
[0014] 所述的结合垫为1层（图1)或2层（图2)，其中2层时错落与分析膜搭接。
[0015] 所述抗OmpC抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0016] 步骤1. OmpC抗原蛋白的制备
[0017] 步骤2.结合垫⑵制备
[0018] (1)纳米金标记物的制备：用20?40nm粒径的纳米金溶液标记OmpC抗原蛋白、 抗人IgG抗体、抗人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)，以及其 他与质控带能形成免疫复合物的蛋白。
[0019] (2)彩色胶乳标记物的制备：用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记OmpC抗原 蛋白、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)，以 及其他与质控带能形成免疫复合物的蛋白。
[0020] (3)结合垫（2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，先用含BSA和糖的缓冲液 预处理并烘干，将步骤（1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的 玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。
[0021] 步骤3.分析膜（3)制备
[0022] (1)检测带（4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带包被蛋白，如结合垫上 的结合蛋白含OmpC,检测带的包被蛋白是抗人IgG或/和IgA。如果结合垫上含有抗人IgG 或/和IgA,检测带包被蛋白为OmpC。
[0023] (2)质控带（5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合 垫标记蛋白是单一的OmpC，质控带的包被蛋白为抗OmpC的抗体；如果结合垫标记蛋白是单 一的抗人IgG或/和IgA抗体，质控带的标记蛋白为对应的抗人IgG抗体的抗体或抗人IgA 抗体的抗体；或者其他结合垫标记蛋白形成免疫复合物的蛋白。
[0024] 步骤4.样品垫制备
[0025] 将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。
[0026] 步骤5.试纸条组装
[0027] 把步骤1?4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定 的长度和宽度，安装在底板和卡壳里。优选地，试纸条长度为6. 5cm，宽度为3_或4_。
[0028] 所述的OmpC抗原蛋白是把全长OmpC基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克 隆到原核或真核表达载体里，表达纯化获得。
[0029] 所述的OmpC抗原蛋白是用多肽合成仪合成含有OmpC重要抗原表位的OmpC多肽， 并偶联到载体蛋白上而获得，载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（0A)、 钥孔血蓝蛋白（KLH)、人血清白蛋白（HSA)及人工合成的多聚赖氨酸（PLL)等。
[0030] 所述的抗人IgG和IgA抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或 多种单克隆抗体或多克隆抗体。
[0031] 所述的抗OmpC的抗体是以OmpC为免疫源，鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠 源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
[0032] 所述的抗人IgG和IgA抗体的抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的抗体，比如 该抗人IgG抗体是鼠抗人IgG，它的抗体是羊抗鼠 IgG的抗体或其他非鼠源的鼠 IgG抗体。
[0033] 在本发明的另一方面，提供一种抗OmpC抗体检测方法，用本发明第一方面方法及 步骤所制备的抗OmpC抗体免疫层析试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤：
[0034] (1)样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0?100倍；
[0035] (2)把上述处理过的样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5?20分钟，观察T线和 c线；
[0036] (3)结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性； T线和C线均不显现，提示试纸失效。
[0037] 本发明的检测原理：
[0038] 选用金标/胶乳等标记OmpC抗原蛋白或其他能与待检样品中目的物结合的蛋白， 喷涂在结合垫上，制成结合垫；在检测带上包被能与标记蛋白-目的物蛋白复合物发生免 疫反应的蛋白，当把待检样本加样到样品垫上后，样本中的OmpC抗体与结合垫上的标记蛋 白形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫方向泳动，此复合物与包被于检测 带上的抗原蛋白发生特异性免疫结合反应，形成金标/胶乳蛋白-抗OmpC抗体-OmpC抗原 蛋白三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带或胶乳颜色；由 于毛细效应继续泳动向前，金标/胶乳兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的 免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带或胶乳颜色，多余的未结合 的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果；若血清 样品中不含有抗OmpC抗体，标记蛋白到达检测线时，不与包被在检测线上的相应蛋白发生 免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标/胶乳兔IgG继续泳动向前与包被于质 控线处的相应包被蛋白发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条 带或胶乳颜色，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。
[0039] 本发明首次将免疫层析技术应用于抗OmpC抗体检测，实现了高特异性、高灵敏度 的检测性能。与现有文献报道的ELISA和化学发光试剂盒相比，本发明的优点主要包括：检 测时间短（5?20min);不需要任何特殊仪器，可实现床边检测和门诊即时检测；操作简便， 只需一步反应，操作人员无需培训，检测成本低；对温度无特殊要求，无需冷冻，储存运输方 便，室温可保存24个月。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1本发明结合垫和检测带各为1条时的侧面结构示意图1。
[0041] 图2本发明结合垫为2层时的侧面结构示意图2。
[0042] 图3本发明检测带2条时的侧面结构示意图3。
[0043] 图4本发明检测带为1条时阳性和阴性结果示意图4。其中4a是条带示意图；4b 为阳性结果；4c为阴性结果；4d和4e表示试纸条失效。
[0044] 图5本发明检测带为2条时阳性和阴性结果示意图5。其中5a是条带示意图；5b 为IgG和IgA均阳性；5c为IgG阳性，IgA阴性；5d为IgA阳性，IgG阴性；5e为阴性结果； 5f和5g表示试纸失效。

【具体实施方式】
[0045] 本发明所述的OmpC抗体检测免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在底板（7)上 由一侧向另一侧顺次相互搭接地粘贴分析膜（3)、结合垫（2)、样品垫（1)、吸水垫（6)。
[0046] 结合垫（2)上喷涂有金标/胶乳标记蛋白，分析膜（3)上设置检测带（4)和质控 带（5)，根据结合垫上标记蛋白的不同，选用相应的检测带包被蛋白和质控带包被蛋白。优 选地，在结合垫上喷涂的标记蛋白为OmpC抗原蛋白和鼠 IgG，则检测带上的包被蛋白为抗 人IgG或/和IgA抗体，质控带上的包被蛋白为抗鼠 IgG。另一优选，在结合垫上喷涂的标 记蛋白为抗人IgG或/和IgA抗体，贝U检测带上的包被蛋白为OmpC抗原蛋白。
[0047] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
[0048] 实施例1. OmpC抗原蛋白制备
[0049] 抗原蛋白制备方法一：重组蛋白
[0050] 1)试剂
[0051] 大肠杆菌宿主菌DH5 a、BL21 (DE3)，克隆载体pCR2. 1 T-vector，表达质粒 pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4 DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LA Taq以及限制性内切酶 BamH I、Hind III 和 EcoR I、BamH I，DL2000 DNA Marker、T4 DNA 连接酶，低分子量标准蛋 白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等
[0052] 2)仪器
[0053] 普通摇床SCS-24 ;隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻 离心机Centrifuge 5810R、台式离心机MiniSpin ;高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝 胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。
[0054] 3)实验方法
[0055] a.载体构建：
[0056] 设计引物CATG ccatgg ATG CAT CAT CAT CAT CAC CAT(NcoI)和 CGC ggatcc TTA GAA CTG GTAAAC CAG GCC(BamHI)从模板DNA中PCR扩增出OmpC片段，胶回收试剂盒回收片 段后连接到pCR2. 1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a (+) 中，酶切位点为EcoR I、BamH I，同时载体上有6XHIS标签，便于后续的蛋白纯化。
[0057] b.表达
[0058] 将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选 出来的阳性菌液按1 : 1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一 管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37°C过夜培养至 0D600值约为0. 4-0. 6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为lmmol/L，非诱导对 照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE 方法对表达产物进行鉴定。
[0059] c.纯化
[0060] 将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，经测定纯化后的蛋白浓 度为 509mg/L。
[0061] OmpC抗原蛋白制备方法2 :
[0062] 筛选OmpC重要抗原表位多肽2-6个，用多肽合成仪进行从从C端（羧基端）向N 端（氨基端）合成，然后与载体蛋白偶联，使分子量增大，便于结合在结合垫和分析膜上。常 用的载体蛋白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（0A)、钥孔血蓝蛋白（KLH)、人 血清白蛋白（HSA)及人工合成的多聚赖氨酸（PLL)等。
[0063] 实施例2抗体制备
[0064] 结合垫及检测带包被抗体抗人IgG单克隆抗体和多克隆抗体，以及用于质控带和 结合垫其他动物来源的单克隆抗体和多克隆抗体，可通过免疫动物获得。
[0065] 1、单克隆抗体制备的具体操作方法为：
[0066] 通过将〇· 05mg?5mg免疫制剂（分别针对山羊、小鼠、兔子、马和豚鼠）与1倍体 积的弗氏完全佐剂混合得到注射溶液，将该注射溶液在动物皮内多部位注射；
[0067] 一个月后将弗氏完全佐剂混合液经多部位动物皮下注射而加强免疫。7?14天后 将动物放血，测定抗血清滴度。
[0068] 对动物加强免疫直至滴度达到平台期。通过从被免疫的动物回收脾细胞与小鼠骨 髓瘤细胞SP2/0融合，筛选后即可得到能稳定表达目的抗体的杂交瘤细胞。
[0069] 体外培养的杂交瘤细胞，接种小鼠或大鼠腹腔，取腹水纯化获得单克隆抗体；或者 从培养上清液中纯化获得单克隆抗体。
[0070] 2、多克隆抗体制备：
[0071] 同单克隆抗体步骤1)和2)，在获得抗血清后，纯化抗血清获得多克隆抗体。
[0072] 3、葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白制备
[0073] 根据葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白的基因序列，可通过大肠杆菌原核表达克隆 化基因来制备，具体操作方法可参见（分子克隆实验指南），或实施例10mpC的步骤。
[0074] 实施例3金标试纸各组分制备
[0075] 1、胶体金液制备
[0076] 将0· 01 % (w/v)的HAuC14溶液加热至沸腾，迅速加入每100mL HAuC14溶液加入 适量的还原剂溶液，颜色从蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7?lOmin出现透 明的橙红色。再用超滤或微孔滤膜（0.45 μ M)过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入 的杂质。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，液面出现油状物和大量黑色 颗粒状沉淀物杂质时弃用。
[0077] 其中所使用的还原剂可以为柠檬酸三钠、鞣酸-柠檬酸三钠、白磷，优选使用柠檬 酸三钠，更优选地使用1% (w/v)柠檬酸三钠。
[0078] 其中所用玻璃容器应绝对清洁，用前需经酸洗。其水应为去离子超纯水，电阻率达 18. 2ΜΩ。
[0079] 胶体金溶液制备过程中，各溶液的配制方法如下：HAuC14的配制：用超纯水溶解氯 金酸，配成1%溶液，置41：备用，有效期三个月 ；100〇1^1%撤11(：14溶液配方：1(^祖11(：14、 超纯水定容至lOOOmLd 1%朽1檬酸三钠 （Sodium Citrate)的配制：用超纯水溶解Sodium Citrate,配成1 %溶液，0· 22 μ Μ膜滤过，现配现用。
[0080] 2、金标蛋白制备
[0081] 本发明待标记金标蛋白包括但不限于鼠抗人IgG单抗、豚鼠抗人IgA多抗、羊抗人 IgA多抗、OmpC抗原蛋白、鼠 IgG、羊IgA、SPA、兔抗人IgG单抗、马抗人IgA多抗、兔IgM、鼠 IgA。
[0082] 用0· 1M碳酸钠调节胶体金pH 6. 8?8. 5,按每毫升胶体金溶液缓慢加入5? 25 μ G待标记蛋白，混匀，静置10?30min，然后加入BSA至终浓度0. 5?1 %，混匀，静置 5?lOmin, 3000rpm离心5min，去沉淀，将上层溶液转至新管，9000rpm离心30min，去上清， 加入重悬液至原量，将溶液移至新管，9000rpm再次离心30min，加入用十分之一初始体积 的保存液将沉淀重悬，置4°C备用。
[0083] 3、分析膜制备
[0084] 分析膜选择：分析膜的材质可选硝酸纤维素膜（NC)或者醋酸纤维素膜，商品化的 硝酸纤维素膜包括 S&SAE99、whatman 8ym、millipore M135、sartorius CN140 等。使用哪 种规格的具体NC膜或醋酸纤维素膜不是本发明的关键，但是在每次测定中，上述几种NC膜 可以作为优选。不同厂家使用的含不同表面活性剂的不同缓冲液处理的膜，与所用检测线 抗体溶液亲和力有不同程度的差距，也会很大程度造成线条不均匀，拖带或是弥散的现象， 因此运用组装试纸来选择优选的NC膜或醋酸纤维素膜。
[0085] 分析膜制备：用包被缓冲液稀释检测带包被蛋白至0. 5?2. 0mG/mL浓度，用划膜 喷金仪HM3035,距离结合垫lcm处，以0. 5?2. 0μ L/cm喷涂于膜上，构成检测带（4)，距离 检测带约5mm处，以0. 5?2. Ο μ L/cm用划膜喷金仪仪器喷涂于同一张膜上，构成质控带 (5)，质控带同时距离吸水垫约lcm。分析膜37°C烘干，封装备用。
[0086] 所使用的包被缓冲液可以是硼酸盐、碳酸盐、磷酸盐、Tris-HCl或Tris-磷酸盐 等，缓冲液的作用是提供一定pH和离子强度使蛋白牢固包被于NC膜，缓冲液pH值一般约 为6?9. 5范围内，优选为6. 5?7. 5的中性缓冲范围内，且最优选缓冲液的pH值为7. 0? 7. 4范围内。
[0087] A.分析膜1
[0088] 检测带1 :将兔抗人IgG与pH为7. 2的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为 0. 2mG/mL的溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为1 μ L/cm。
[0089] 检测带2 :将羊抗人IgA与pH为7. 3的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为 0. 3mG/mL的溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为1 μ L/cm。
[0090] 质控带：将羊抗鼠 IgG与pH为7. 5的10mM PB缓冲溶液混合配制成为浓度为 0. 5mG/mL混合溶液，喷在硝酸纤维膜上，涂布量为1 μ L/cm。
[0091] Β·分析膜2
[0092] 检测带：将羊抗人IgG及鼠抗人IgA与pH为7. 5的10mM碳酸盐缓冲溶液分别配 制成浓度为〇. 8mG/mL和1. OmG/mL的混合溶液，1 : 1混匀，喷在醋酸纤维膜上，涂布量为 1 μ L/cm〇
[0093] 质控带：用pH为7. 5的10mM碳酸盐缓冲溶液配制鼠抗兔IgM，浓度为0. 3mG/mL， 喷涂在醋酸纤维膜上，涂布量为1 μ L/cm。
[0094] C.分析膜3
[0095] 检测带1 :用pH为7· 5的10mM PB缓冲溶液配制豚鼠抗人IgG，浓度为0· 5mg/mL， 喷涂在硝酸纤维膜上，涂布量为1. 2 μ L/cm。
[0096] 检测带2 :用pH为7· 4的10mM PB缓冲溶液配制豚鼠抗人IgA，浓度为0· 3mg/mL， 喷涂在硝酸纤维膜上，涂布量为1. 2 μ L/cm。
[0097] 质控带：用pH为7. 1的10mM PB缓冲溶液配制兔抗OmpC多抗，浓度0. 4mG/mL，喷 涂在硝酸纤维膜上，涂布量为1 μ L/cm。
[0098] D.分析膜4
[0099] 检测带：用pH为6. 8的重组抗原蛋白OmpC，浓度为为0. 3mG/mL，喷涂在醋酸纤维 膜上，涂布量为1.0 μ L/cm。
[0100] 质控带：用pH为7. 0的10mM PB缓冲溶液配制豚鼠抗羊IgG，浓度为0. 2mG/mL，喷 涂在醋fe纤维I旲上，涂布量为1. 0 u L/cm。
[0101] Ε·分析膜5
[0102] 检测带：用pH为6. 8的多肽偶联抗原蛋白OmpC，浓度为为0. 4mG/mL，喷涂在硝酸 纤维膜上，涂布量为1. 0 μ L/cm。
[0103] 质控带：用pH为7. 0的10mM PB缓冲溶液配制鼠抗马IgG，浓度为0. 2mG/mL，喷涂 在硝酸纤维膜上，涂布量为1. 〇 μ L/cm。
[0104] 4、结合垫的制备
[0105] 结合垫的处理：结合垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的结合垫处理液浸 泡结合垫，在37°C下lh烘干后，将抗体或者蛋白以4uL/cm的用量喷涂在预处理的聚脂膜 上，37°C干燥lh后得结合垫，结合垫置于2?8°C的环境下备用；结合垫处理液的组成为： pH 为 7.0 ?9.0 的 10mM PB 缓冲溶液，含 1%BSA，10 ?20%蔗糖，0.1 % Tween-20。结合 垫也可不做预处理，直接使用。
[0106] A.结合垫1玻璃纤维膜，双层，2a层为OmpC重组蛋白，2b层为鼠 IgG。
[0107] B.结合垫2聚酯膜，双层，2a为OmpC重组抗原蛋白，2b层为兔IgM。
[0108] C.结合垫3玻璃纤维膜，单层，OmpC多肽偶联蛋白。
[0109] D.结合垫4玻璃纤维膜，单层，羊抗人IgG和羊抗人IgA各50%。
[0110] E.结合垫5聚酯膜，双层，2a层为豚鼠抗人IgA，2b层为马IgG。
[0111] 5、样品垫的制备
[0112] 样品垫材质为玻璃纤维纸或聚酯膜，用配制好的样品垫处理液浸泡样品垫，在 37°C下lh烘干，样品垫缓冲液的组成为：pH为7. 0?9. 0的10Mm PB缓冲溶液，含1 % BSA， 10%鹿糖，〇. 1% Tween-20。样品垫也可不做预处理直接使用。
[0113] 实施例4胶体金标记抗OmpC抗体检测试纸1?5制备
[0114] 用裁切机将实施例3制备的并干燥的样品垫、结合垫、分析膜、吸水纸分别剪切 1. 7cm、0. 8cm、2. 5cm和1. 5cm宽的窄条，按图1或图2方式搭接成大板，用切条机将大板切 成单人份，每人份宽度根据底板卡壳的不同而异，本发明优选3mm和4mm宽度。将单人份已 切好的试纸组装在备好的试纸卡里，使加样窗对应试纸的样品垫，结果显示窗对应检测区 和质控区，组装时温度控制在25?37 °C，湿度20?30 %。
[0115] 金标试纸条1?5的各组分如下表：
[0116]

【权利要求】
1. 一种抗OmpC抗体免疫层析试纸条，包括样品垫（1)、结合垫（2)、分析膜（3)、吸水垫 (6)、底板（7)、检测带（4)和质控带（5)，所述底板（7)的上部贴合有分析膜（3)，所述分析 膜（3)上部的两端分别贴合有结合垫（2)和吸水垫（6)，所述结合垫（2)上部的一端贴合有 样品垫（1)，所述检测带⑷和质控带（5)设置在分析膜（3)上，其特征在于，OmpC抗原蛋 白结合在结合垫（2)上或包被在检测带（4)上。
2. 根据权利要求1所述的OmpC抗体检测试纸条，其特征在于，所述的结合垫为1层，如 图1所示与分析膜搭接，或者分上（2a)、下（2b)两层与分析膜错落搭接（图2)。
3. 根据权利要求1所述的OmpC抗体检测试纸条，其特征在于，所述的检测带（4)设1 条（图1)或2条（图3)。
4. 一种抗OmpC抗体免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤： 步骤1. OmpC抗原蛋白的制备 步骤2.结合垫⑵制备 (1) 胶体金标记物的制备：用纳米金溶液标记OmpC抗原蛋白、抗人IgG抗体、抗人IgA 抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)，以及其他与检测带和质控带能形 成免疫复合物的蛋白。 (2) 胶乳标记物的制备：用带活性基团的胶乳微球标记OmpC抗原蛋白、抗人IgG抗体、 抗人IgA抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)，以及其他与检测带和质 控带能形成免疫复合物的蛋白。 (3) 结合垫（2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤（1)制备的胶体金标记 物或胶乳标记物，用喷涂仪喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。 步骤3.分析膜（3)制备 A. 检测带（4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带包被蛋白，如结合垫上的结 合蛋白含OmpC，检测带的包被蛋白是抗人IgG抗体或/和抗人IgA抗体；如果结合垫上含 有抗人IgG抗体或/和抗人IgA抗体，检测带包被蛋白为OmpC抗原蛋白。 B. 质控带（5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合垫标 记蛋白是单一的OmpC,质控带的包被蛋白为抗OmpC的抗体；如果结合垫标记蛋白是单一的 抗人IgG或/和抗人IgA抗体，质控带的标记蛋白为对应的抗人IgG或IgA抗体的抗体；结 合垫标记蛋白有2层时，质控带的包被蛋白是能与结合垫对应层结合蛋白形成免疫复合物 的蛋白。 步骤4.样品垫制备 将玻璃纤维膜或聚酯膜经缓冲液浸渍烘干备用，或者直接使用。 步骤5.试纸条组装 把步骤1?4所制作完成的材料，按图1或图2搭接，根据底板的规格切割成一定的长 度和宽度，安装在底板和卡壳里。
5. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的OmpC抗原蛋白是把全 长OmpC基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表达载体里，表达纯化 获得。
6. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的OmpC抗原蛋白是用多 肽合成仪合成含有OmpC重要抗原表位的OmpC多肽，并偶联到载体蛋白上而获得，载体蛋 白包括但不限于牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（0A)、钥孔血蓝蛋白（KLH)、人血清白蛋白 (HSA)及人工合成的多聚赖氨酸（PLL)等。
7. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG和IgA抗体为 鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源中的一种或多种单克隆抗体或多克隆抗体。
8. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗OmpC的抗体是以 OmpC为免疫源产生的抗体，或者能与OmpC形成免疫复合物的蛋白。
9. 根据权利要求4所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述的抗人IgG和IgA抗体的 抗体是指能与该抗体形成免疫复合物的蛋白。
10. -种抗OmpC抗体检测方法，其特征在于，用权利要求1-9所述的免疫层析试纸条， 对待检样品进行检测，具体步骤包括： (1) 样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释〇?100倍； (2) 把样品滴加到试纸条的样品垫上，静置5?30分钟，观察T线和C线； (3) 结果判读：T线和C线均显现，结果为阳性；T线不显现，C线显现，结果为阴性；T线 和C线均不显现或其他现象，提示试纸失效。
【文档编号】G01N33/543GK104297465SQ201410411682
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】陈菲, 吴根现, 周阳, 霍如松 申请人:苏州和锐医药科技有限公司