一种微流控多色荧光细胞计数仪的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种微流控多色荧光细胞计数仪，包括微流控芯片系统、荧光光源系统和分析计数系统；所述的微流控芯片系统包括微流控芯片(3)、计算机控制的控制器(18)和管道(20)；所述的荧光成像系统包括激光器A(9)、激光器B(12)、荧光探测的物镜(8)、和信号处理的摄像机(17)；所述的分析计数系统包含计算机(19)。本发明将所述微流控多色荧光细胞计数仪结合磁性细胞分选技术和免疫细胞化学染色技术，用于结肠癌外周血循环肿瘤细胞的检测，通过微流控分析计数系统对肿瘤细胞进行分析、计数，实现细胞计数及形态的分析。
【专利说明】一种微流控多色荧光细胞计数仪
【技术领域】
[0001]本发明属于流式细胞检测领域，特别涉及一种基于微流控芯片的多色荧光细胞计数仪。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(CTCs)是指从原位瘤脱离出来并进入血液循环的细胞，这些细胞具有在机体内其它部位附着并形成新的癌转移灶的潜能。CTC在多种癌症患者体内都有发现，其具有原发灶细胞的生物学特征，可在机体浅表的外周血中检出，被认为在反映癌症恶性程度及预后方面具有重要的应用价值，其数量的统计有可能成为判断癌症转移、复发、预后的重要指标。因此，如何高效、快速、准确的对获取的CTCs进行计数分析已成为基于循环肿瘤细胞为主的癌症诊断系统研发和应用的关键问题之一。
[0003]—般获取CTC的方法是使用免疫磁球对血液中的CTC进行捕获，磁分离后，对捕获的循环肿瘤细胞进行标记分析。其基本原理是使用特异性的荧光染料对目标细胞进行标记，利用荧光显微镜中的荧光激发光源进行激发，检测荧光标记后静态或动态细胞的荧光信号，并进行统计分析。一般的荧光细胞计数仪能自动检测和计数循环肿瘤细胞，虽然这些仪器已具有强大功能，但其也存在一些需要改进的地方。首先，仪器中的荧光计数装置的相关设备需要与CTCs磁分离捕获装置配合使用，这无疑增加了仪器本身及相应组件的成本，使其较难普及应用；第二，捕获CTC的免疫磁球仅采用单一的抗EpCAM抗体修饰，免疫磁球的单一性严重影响了其对复杂的肿瘤细胞的捕获效率。第三，仪器中的荧光计数装置需要通过人工计数荧光染色的细胞个数，人工计数不但增加了样品分析的时间，且在一定程度上降低了计数的稳定性和一致性。因此，市场及临床迫切需要一种价格低廉，具有自主研发优势，并且可以很好的灵活应用于普通消费群体的CTCs荧光分析及评判装置。
[0004]微流控芯片技术是20世纪90年代发展起来的学科，是指操作微小网络通道(5-500微米)中流体的科学技术。微流控芯片是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，可传输微升(UL)到纳升(nL)甚至皮升(pL)量级的流体，并将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在一块或几块微流体芯片上，具有信息通量大、自动化、系统化的特点。微流控芯片具有可集成化、易自动化操作的特点使其与常规生物分析相比有很多潜在的优势，在生物医学分析领域有着越来越多的应用。目前以微流控芯片为基础的仪器例如PCR，蛋白结晶仪，DNA测试仪都已经相继问世。
【发明内容】
[0005]发明所要解决的技术问题
[0006]本发明所要解决的技术问题提供一种荧光标记后循环肿瘤细胞的快速准确计数的仪器，填补结合微流控芯片技术和免疫细胞化学技术，进行准确的循环肿瘤细胞检测和分析的技术空白。
[0007]技术方案
[0008]本发明提供的技术方案之一为一种微流控多色荧光细胞计数仪，包括微流控芯片系统、荧光光源系统和分析计数系统；所述的微流控芯片系统包括微流控芯片、计算机控制的控制器和管道；所述的荧光光源系统包括两种或以上激光器，如激光器A和激光器B、荧光探测的物镜、和信号处理的摄像机；所述的分析计数系统包含计算机。
[0009]上述的技术方案的优选方式之一为，所述的微流控芯片系统还可选地含有、载物台、电机、导轨和丝杆之一或以上。
[0010]上述的技术方案的优选方式之二为，所述的荧光成像系统还可选地含有照明光源、聚光镜、物镜、扩束镜A、二向色镜1、扩束镜B、二向色镜2、滤光片转轮之一或以上。
[0011]上述的技术方案的优选方式之三为，所述的物镜优选40倍光学物镜，所述的激光器A优选405nm,所述的激光器B优选488nm。
[0012]上述的技术方案的优选方式之四为，所述的微流控芯片的材质为硅酮；具有三维结构；芯片厚度小于50微米；芯片内样品容量小于10微升；芯片表面采用EpCAM抗体修饰。
[0013]上述的技术方案的优选方式之五为,所述的突光光源系统设两种突光激发光源；所述激光器(A)荧光激发光源激发被4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞，产生蓝色荧光；所述激光器(B)荧光激发光源激发被异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)染色的细胞，分别产生绿色荧光和红光荧光。
[0014]本发明提供的技术方案之二为一种微流控多色荧光细胞计数仪的制备方法，包括以如下步骤制备微流控芯片，
[0015]I)旋涂光刻胶于硅片表面，固化，紫外曝光后显影，制作微流控芯片模板；
[0016]2)硅酮(PDMS)按A:B为5:1混合，在真空中脱气，倒入置有模具的培养皿中，倒胶厚度5毫米，80°C加热固化60min后将PDMS与模具分离；
[0017]3)打孔，将上下两层PDMS对准，粘合；80°C烘烤I小时。
[0018]本发明提供的技术方案之三为上述的细胞计数仪用于血液中循环肿瘤细胞的计数和图像分析。
[0019]本发明提供的技术方案之四为上述的细胞计数仪用于结直肠癌循环肿瘤细胞计数。
[0020]本发明提供的技术方案之五为上述的细胞计数仪的应用，包括预先进行循环肿瘤细胞磁分离及鉴定；或者，包括在微流控芯片内进行细胞形态及荧光标记状态分析。
[0021]所述的微流控多色荧光细胞计数仪用于对样本中的循环肿瘤细胞进行计数和分析；
[0022]所述的荧光光源系统用于对微流控芯片上的肿瘤细胞进行荧光激发、拍照和细胞计数；包含一个靠近微流控芯片的光源装置，设三种荧光激发光源，DAPI蓝光、FITC绿光和PE红光；一个靠近所述微流控芯片和所述光源装置的荧光探测装置；一个与荧光检测装置相连的信号处理器。
[0023]所述的分析计数系统包含软件及计算机控制模块，用于荧光图像的采集及肿瘤细胞的自动计数及自动分析产生数据。
[0024]本发明的多色荧光细胞计数仪设置有计算机接口，通过计算机对分析计数系统进行控制。
[0025]本发明的肿瘤细胞荧光检测仪关键光学部分可选择万能无限远校正光学系统。光线通过无限远色差校正物镜后成为平行光束，该平行光束经管镜成像到CCD感光芯片。物镜与管镜之间可添加光学附件而不影响总放大倍数。
[0026]本发明所述的微流控多色荧光细胞计数仪的应用包括血液中循环肿瘤细胞的计数和图像分析，使用时需配合相应的循环肿瘤细胞磁分离及鉴定系统；另外还包含微流控芯片内的细胞形态及荧光标记状态分析。
[0027]有益效果
[0028]I)本发明结合微流控芯片技术、免疫细胞化学技术和多色荧光分析技术对细胞特别是循环肿瘤细胞的个数进行自动统计，同时对细胞的微观形态进行图像的采集和分析，并可进一步实现对循环肿瘤细胞在分子及基因方面的分析，结果可靠性高；
[0029]2)另一方面，利用分析计数装置进行循环肿瘤细胞检测与计数，减少人工操作时间和处理程序。
[0030]3)与本发明的微流控多色荧光细胞计数仪配套使用的细胞抓捕系统包含的免疫磁性微球技术是以免疫学为基础，利用包被有免疫活性物质的各种微球进行免疫学或其它生物学检测的新技术；此项技术由于具有快捷、简便、分离纯度高等优点已被广泛使用到各个领域并已取得巨大进展。
[0031]本发明中所涉及的微流控芯片具有以下特点:
[0032]A.利用微流控芯片对微米尺度流体中细胞的精确操控能力，可对加入芯片的CTC细胞进行精确操作，通过微流控芯片的准确设计，实现芯片中CTC单细胞层；
[0033]B.微流控芯片的三维结构设计，不但实现芯片内单细胞层，而且维持芯片的结构强度(芯片中条形骨架结构)，同时设计特殊标记，方便多色荧光分析仪器的精确定位分析CTC细胞。
[0034]C.结合多色荧光分析仪器，来实现单个细胞的荧光分析和快速计数。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是本发明专利的工作流程示意图。图例:照明光源(I)、聚光镜(2)、微流控芯片⑶、载物台(4)、电机(5)、导轨(6)、丝杆(7)、物镜(8)(优选40倍)、激光器A(9)、(优选405nm)扩束镜A (10)、二向色镜I (11)、激光器B (12)(优选488nm)、扩束镜B (13)、二向色镜2 (14)、滤光片转轮(15)、管镜(16)、摄像机(17)、控制器(18)、计算机(19)、管道(20)；
[0036]图2是微流控芯片(3)的结构示意图；
[0037]图3是在微流控芯片(3)上读取的进行免疫染色后的细胞荧光显微镜图像。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0039]实施例1
[0040](I)结直肠癌CTC的捕获及荧光标记
[0041]采用外周血CTC高精度分离试剂盒(上海柏慧康生物科技有限公司)对外周血中结直肠癌细胞(复旦大学附属肿瘤医院，10份，每份5.0mL)进行捕获及荧光标记。对结直肠癌细胞的模拟捕获实验分为两个过程，首先将结直肠癌HT29细胞与其它正常细胞(293T细胞，淋巴细胞和巨噬细胞(美国模式培养物集存库(ATCC)))共混验证外周血CTC高精度分离试剂盒对CTC细胞的分离功能，同时与微流控多色荧光CTC计数仪对接；其次，对获取的结直肠癌患者外周血进行CTC捕获鉴定试验。
[0042]其中磁分离及染色的具体过程为:提取5.0mL外周血样本，800转/分离心分离后，抽取上层血清混合液；加入50 μ L标记抗-EpCAM抗体(美国Sigma公司)的铁磁流体(质量浓度0.5% )和2.0mL磷酸盐缓冲液(浓度0.lmol/L);磁性孵育；磁性分离抽取未标记细胞；再次悬浮在磷酸盐缓冲液中，分别加入DAPI染色液(碧云天生物)、CK19染色液(Eb1science，货号 53-9898-82)和 CD45 染色液(Eb1science，货号 12-0459-42)赋予染色15min，分别磁性分离收集染色后的细胞。
[0043]标记荧光染色试剂的细胞一抗-CK-PE识别细胞内细胞角质蛋白8、18和/或19 ;DAPI将细胞核物质染色；抗-CD45-APC识别白血球；对染色后的CTC细胞进行磁分离洗涤以备后续使用。其中，荧光染色采用三种荧光试剂分别为DAPI染核(蓝光)，PE-抗CD45标记白细胞(红光)，FITC-抗CK蛋白标记上皮肿瘤细胞(绿光)。
[0044]控制最后微流控多色荧光CTC检测仪的进样量为5 μ L，固体物质含量彡0.5%。
[0045](2)微流控芯片3的构建
[0046]微流控芯片3主要是利用微流控芯片对微米尺度流体中微小物体(细胞)的精确操控能力对加入芯片的CTC细胞进行精确操作，通过微流控芯片的准确设计，实现芯片中CTC单细胞层，结合多色荧光分析仪器，来实现单个细胞的荧光分析和快速计数。
[0047]微流控芯片3将采用标准软刻蚀技术(softlithography),旋涂光刻胶于娃片表面，固化，紫外曝光后显影，制作微流控芯片模板。硅酮(PDMS)(国药化学试剂有限公司)按A:B为5:1混合，并在真空中脱气，倒入置有模具的培养皿中，倒胶厚度5毫米，80°C加热固化60min后将PDMS与模具分离。打孔，将上下两层PDMS对准，粘合。80°C烘烤I小时。微流控芯片3包括管道20(包括内壁立体图案修饰)、进样口、出样口等部分组成，管道20内壁一侧或双侧进行表面修饰。进样、洗涤、转移和出样都由微型电磁阀通过控制系统的编程数码操作，进样量由微型计量泵和芯片内置阀门系统精确控制。
[0048](3)微流控多色荧光CTC检测仪的构建
[0049]微流控多色荧光细胞计数仪的荧光光源系统包含微流控芯片3 (单细胞层覆盖)及进样装置；一个靠近微流控芯片3的光源I装置；一个靠近所述微流控芯片3和所述光源I装置的荧光探测装置；一个与荧光检测装置相连的信号处理器。其中的微流控装置上覆盖以进行荧光标记的循环肿瘤细胞，细胞通过过程中可被来自所述光源列的光束撞击，并因此发出荧光信号；这些不同的荧光信号会返回到处理器进行处理分析，统计。其装置原理示意图见微流控多色荧光CTC计数仪示意图。
[0050](4)微流控多色荧光CTC检测仪的应用
[0051]将以上来源的结直肠癌患者10例的外周血采用微流控荧光细胞计数仪进行CTC计数统计和分析，结果显示15例癌症患者统计出来的循环肿瘤细胞个数分别为6、16、92、213、112、66、65、26、17、9，其结果与人工计数的结果无显著差异，误差范围在±5.0%以内，并与实际的临床资料相符。上述的微流控多色荧光细胞计数仪分析结果与传统病理人工计数结果的一致性表明，本发明的计数仪可以实现快速准确地实现外周血中循环肿瘤细胞的检测。可以应用于早期诊断、肿瘤转移、化疗效果、预后的关系研究；也可以用于术后患者血中循环肿瘤细胞的检测，检测结果与预测复发、转移及其预后的关系，检测结果与用药判定关系的初步研究；或者进一步根据对初治和术后患者的检测分析，初步建立早期诊断、判定复发、指导用药、预测预后的相关标准或指导方案。
[0052]实施例2
[0053]微流控多色荧光细胞计数仪的荧光成像计数系统的工作流程。
[0054]肿瘤细胞荧光检测仪关键组成部分，荧光成像系统的精确结构见附图1。本实施例采用万能无限远校正光学系统。光线通过无限远色差校正物镜8后成为平行光束，该平行光束经管镜16成像到CCD感光芯片。物镜8与管镜16之间可添加光学附件而不影响总放大倍数。
[0055]该荧光显微镜可快速区分癌细胞与正常细胞，工作步骤如下:
[0056]1.被测细胞分别用DAP1、FITC和PE荧光试剂染色；
[0057]2.被测细胞装载到微流控芯片3中，将微流控芯片3置于载物台4上；
[0058]3.将二向色镜214移出光路，滤光片转轮15切换到空档(不安装滤光片)；
[0059]4.照明光源I和聚光镜2装置用于照明被测细胞，可观察细胞形态。打开照明光源I，调节聚光镜2的光圈，直到亮度适中；
[0060]5.调节显微镜镜座的粗调旋钮及细调旋钮，直到通过摄像机17可拍摄到清晰的图像；
[0061]此步骤可用于观察细胞形态。
[0062]6.关闭照明光源I。
[0063]7.滤光片转轮15切换到461nm档位；
[0064]8.二向色镜111安装于光路中，二向色镜214被移出光路；
[0065]9.打开405nm激光器A 9，激光经扩束镜A10、40倍物镜8照射到被测细胞上，被DAPI荧光染料标记的细胞被激发后产生蓝色荧光，中心波长为461nm。此时通过摄像机17可观察到蓝色荧光图像；
[0066]此步骤用于观察DAPI荧光染料标记的细胞产生的蓝色荧光。
[0067]10.滤光片轮切换到525nm档位；
[0068]11.二向色镜111被移出光路，二向色镜214安装于光路中；
[0069]12.打开488nm激光器B 12，激光经扩束镜B13、40倍物镜8照射到被测细胞上，被FITC荧光染料标记的细胞被激发后产生绿色荧光，中心波长为525nm。此时通过摄像机
(17)可观察到绿色荧光图像；
[0070]此步骤用于观察FITC荧光染料标记的细胞产生的绿色荧光。
[0071]10.滤光片转轮15切换到670nm档位；
[0072]11.二向色镜111被移出光路，二向色镜214安装于光路中；
[0073]12.打开488nm激光器B12，激光经扩束镜B13、40倍物镜8照射到被测细胞上，被PE荧光染料标记的细胞被激发后产生红色荧光，中心波长为670nm。此时通过摄像机17可观察到红色荧光图像；
[0074]此步骤用于观察PE荧光染料标记的细胞产生的红色荧光。
【权利要求】
1.一种微流控多色荧光细胞计数仪，包括微流控芯片系统、荧光成像系统和分析计数系统；所述的微流控芯片系统包括微流控芯片(3)、计算机(19)控制的控制器(18)和管道(20);所述的荧光光源系统包括两种或以上激光器，如激光器A(9)和激光器B(12)、荧光探测的物镜(8)、和信号处理的摄像机(17);所述的分析计数系统包含计算机(19)。
2.根据权利要求1所述的细胞计数仪，其特征在于，所述的微流控芯片系统还可选地含有载物台(4)、电机(5)、导轨(6)和丝杆(7)之一或以上。
3.根据权利要求1所述的细胞计数仪，其特征在于，所述的荧光成像系统还可选地含有照明光源(I)、聚光镜⑵、物镜(8)、扩束镜A(1)、二向色镜I (11)、扩束镜B(13)、二向色镜2 (14)、滤光片转轮(15)之一或以上。
4.根据权利要求1所述的细胞计数仪，其特征在于，所述的物镜(8)优选40倍光学物镜，所述的激光器A (9)优选40511111，所述的激光器8(12)优选488nm。
5.根据权利要求1所述的细胞计数仪，其特征在于，所述的微流控芯片(3)的材质为硅酮；具有三维结构；芯片厚度小于50微米；芯片内样品容量小于10微升；芯片表面采用EpCAM抗体修饰。
6.根据权利要求1所述的细胞计数仪，其特征在于，所述的荧光光源系统设两种荧光激发光源；所述激光器(A)荧光激发光源激发被4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞，产生蓝色荧光；所述激光器(B)荧光激发光源激发被异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)染色的细胞，分别产生绿色荧光和红光荧光。
7.一种微流控多色荧光细胞计数仪的制备方法，包括以如下步骤制备微流控芯片⑶， 1)旋涂光刻胶于硅片表面，固化，紫外曝光后显影，制作微流控芯片(3)模板； 2)硅酮(PDMS)按A:B为5:1混合，在真空中脱气，倒入置有模具的培养皿中，倒胶厚度5毫米，80°C加热固化60min后将PDMS与模具分离； 3)打孔，将上下两层PDMS对准，粘合；80°C烘烤I小时。
8.权利要求1所述的细胞计数仪用于血液中循环肿瘤细胞的计数和图像分析。
9.权利要求1所述的细胞计数仪用于结直肠癌循环肿瘤细胞计数。
10.权利要求1所述的细胞计数仪的应用，包括预先进行循环肿瘤细胞磁分离及鉴定；或者，包括在微流控芯片(3)内进行细胞形态及荧光标记状态分析。
【文档编号】G01N15/14GK104280329SQ201410441265
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】沈鹤柏, 袁旭军, 隋国栋, 梁晓飞 申请人:上海柏慧康生物科技有限公司