一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，通过配置反应液及显色液，制备标准曲线，最后可获得待测样品的氨基酸脱羧酶的酶活力。该方法成本低廉；重复性好，在酶浓度在0.001U~0.006U/μL之间线性关系良好；操作简单，仪器要求不高；方法可靠，适用面广，可检测多种氨基酸脱羧酶。本发明方法的公开，对于研究动物组织、微生物培养液、细胞培养以及血液样本中的氨基酸脱羧酶活力变化至关重要。
【专利说明】一种快速定量检测氨基酸脱竣酶的比色方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方 法。
【背景技术】
[0002] 氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase)是催化脱去某种氨基酸的羧基，生 成对应胺（如下列括弧中所示）的裂解酶之总称：NH2CHRC00H -NH2CH2R+C02。主要是在酸 性培养基上生长的细菌中发现的，在动物、植物中虽然很少，但也可以找到。在细菌中已知 具有赖氨酸（尸胺）、酪氨酸（酪胺）、精氨酸（鲱精胺）、鸟氨酸（腐胺）、谷氨酸（Y -氨 基丁酸）等相应的专一性的脱羧酶，这些酶均以磷酸吡哆醛为辅酶。在动物组织中具有谷 氨酸（Y -氨基丁酸）、酪氨酸（酪胺）、组氨酸（组胺）、半胱氨酸（牛磺酸）、5_羟色氨酸 (5-羟色胺）相应的专一性的脱羧酶，多以磷酸吡哆醛为辅酶。氨基酸脱羧生成的胺类在 动物体内有许多是在生理上、药理上起重要作用的，在细菌中具有中和酸性培养基的作用。 然而目前还没有快速定量检测氨基酸脱羧酶活力的详细的方法和商品化的试剂测试盒。为 了替代传统成本高昂，放射性物质污染等检测方法（需要液闪仪），目前已有专利报道采用 羧化酶酶偶联固定CO 2的技术检测氨基酸脱羧酶活力，但操作方法不够详细，操作起来很困 难。基于此原理，本发明旨在发明一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，开发商品化 的检测试剂盒，形成详细可行的操作步聚，这对于研究动物组织、微生物培养液、细胞培养 以及血液样本中的氨基酸脱羧酶活力变化至关重要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是在于提供了一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，方法易 行，成本低廉，能够在70分钟内完成检测工作，且仅需恒温水浴锅以及分光光度计等常规 仪器。广谱性强，能同时对应检测多种氨基酸。效果稳定，操作简便。
[0004] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0005] -种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，其具体步骤如下：
[0006] (1)反应液与显色液试剂组成及配制
[0007] 反应液：即配即用，将试剂2溶于试剂1中即可。
[0008] 试剂 I :50mmol/L Tris (pH7. 5), 10mmol/L MgCl2, 2mmol/LPEP 单环已胺盐，5mmol/ L氨基酸，采用无CO2蒸馈水配制；
[0009] 所述的氨基酸为待检测的氨基酸脱羧酶对应的氨基酸；
[0010] 试剂 2 :5U/mg PEP 羧化酶；
[0011] 显色液：试剂3 :50mg/ml固紫B，1%吐温-80溶液，采用无CO2蒸馈水配制；
[0012] 试剂4:脱羧酶标准品。
[0013] 以上溶液均采用无CO2双蒸水配制，无CO2双蒸水的制作方法：临用前将双蒸水加 热至沸腾后，继续加热5min，冷却后密封待用。
[0014] (2)标准曲线试剂配制
[0015] 将脱羧酶标准品配制成 0,0? 001，0. 002,0. 003,0. 004,0. 005,0. 006,0. 007， 0. 008U/i! L浓度梯度的酶溶液，溶剂为匀浆介质。
[0016] pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L 蔗糖，0.8% 的 氯化钠溶液。
[0017] (3)标准曲线的制备
[0018] ①移取450 ii L反应液到离心管；
[0019] ②加入50 L步骤（2)中配制的标准品，上下颠倒数次，混匀；
[0020] ③37°C下孵育lh，每隔IOmin上下颠倒混匀数次；
[0021] ④加入25 L显色液与反应体系中，上下颠倒数次，混匀；
[0022] ⑤静置5min，Icm光径，蒸馏水调零，520nm，测各管吸光度（OD)值；
[0023] ⑥重复实验步骤①至⑤9次；
[0024] ⑦构建标准曲线：纵坐标（Y轴）为吸光单位的实际读数；横坐标（X轴）为标准脱 羧酶酶活力单位（U)，为标准品酶浓度X 50 ii L ;
[0025] (4)待测样品测定方法
[0026] ①移取450 ii L反应液到离心管；
[0027] ②向离心管中加入50 ii L待测样品或50 ii L匀浆介质；上下颠倒数次，混匀；
[0028] ③37°C下孵育Ih,每隔IOmin上下颠倒混匀数次；加入25 ii L显色液于反应体系 中，上下颠倒数次，混匀；
[0029] ④静置5min，Icm光径，蒸馏水调零，520nm，测各管吸光值OD ;
[0030] ⑤根据OD ^和标准曲线计算样品对应的酶浓度E ^ (U/ ii L)，E ^与曲线X的值 的对应关系为：E_#= x/50。
[0031] ⑥计算样品比活力：E#s= E实_ X样品稀释倍数+样品总蛋白浓度。
[0032] 待测样品中，若需检测待测溶液中多种氨基酸脱羧酶的比活力，可仅以某一种氨 基酸脱羧酶标准曲线为准。
[0033] 所述的匀浆介质的配方为：pH 7. 4,0. 01mol/L Tris-Hcl，0. OOOlmol/L ￡0丁4-2恥，0.01111〇1/1蔗糖，0.8%的氯化钠溶液。
[0034] 以上所述方案中，针对待测溶液的制备，采用本领域的常规方法，优选采取以下方 法：
[0035] 对于微生物溶液样品，IOOOOrpm,离心5min，倾去上清，用生理盐水或PBS反复清 洗沉淀2?3次，再IOOOOrpm,离心5min，倾尽上清，用生理盐水稀释至0. 80D，取IOmL, IOOOOrpm,离心5min，倾尽上清，加入500 ii L勻楽介质或生理盐水，将离心管插入冰中，用 振幅30微米超声处理20s，置于冰上冷却，反复超声处理3次，使细胞破碎，放进4°C台式离 心机15min，速度为16000g，小心移去500 ii L上清液到新的预冷的I. 5mL离心管置于冰槽 里，检测总蛋白含量待用。
[0036] 对于动物组织样品，称取组织样品Ig于4°C稳定后的冰生理盐水或PBS缓冲液反 复漂洗2?3次，每次不得低于5mL，除尽血液等杂质，滤纸吸干，再次称重，置于IOmL离 心管中插入冰中待用。将组织样本放入IOmL离心管中，用移液枪取预冷的匀浆介质（PH 7.4,0.01111〇1711'1^8-此1，0.0001111〇171￡0了六-2恥，0.01111〇171蔗糖0.8%的氯化钠溶液）， 匀浆介质的体积总量应该是组织块重量的9mL，用移液枪取总量2/3的匀浆介质或者生 理盐水于离心管中，用干净预冷的剪刀将组织块剪碎入离心管中，用组织匀浆机10000? 15000rpm上下研磨成10%的组织匀浆（匀浆IOs/次，间歇30s，连续3?5次，整个过程需 要在冰水中进行直至研磨均匀），最后将剩余的1/3匀浆介质冲洗匀浆机刀口，液体收集于 匀浆用的离心管中。制备好的10%匀浆用低温低速离心机2000rpm左右离心10?15min， 小心的移取上清液分装于预冷的I. 5mL离心管中，检测总蛋白含量待用。
[0037] 本发明提供的快速检测脱羧酶酶活力的方法，同现有方法相比具备以下特点：
[0038] 1、成本低廉；
[0039] 2、提供了仔细完整的实验操作步骤；
[0040] 3、重复性好，在酶浓度在0. OOlU?0. 006U/ii L之间线性关系良好；
[0041] 4、操作简单，仪器要求不高；
[0042] 5、方法可靠，适用面广，可检测多种氨基酸脱羧酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1为实施例1中酪氨酸脱羧酶标准曲线示意图。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1 :
[0045] 一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，其具体步骤如下：
[0046] 以猪结肠微生物菌体样品为例，测定结肠微生物菌体赖氨酸脱羧酶、谷氨酸脱羧 酶、酪氨酸脱羧酶、甘氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、组氨酸脱羧酶、甲硫氨酸脱羧酶和精氨酸 脱羧酶。
[0047] 1 ?试剂
[0048] (1)反应液与显色液试剂组成及配制
[0049] 快速定量检测脱羧酶比色方法的试剂配方见表1。
[0050] 反应液：即配即用，将试剂2溶于试剂1中即可。
[0051] 试剂 I (100ml) :50mmol/L Tris (pH7. 5)，10mmol/L MgCl2, 2mmol/LPEP 单环已胺 盐，5mmol/L氨基酸，采用无CO2蒸馈水配制；
[0052] 所述的氨基酸为待检测的氨基酸脱羧酶对应的氨基酸；
[0053] 试剂 2 (20mg) :5U/mg PEP 羧化酶；
[0054] 显色液：试剂3 :50mg/ml固紫B 1 %吐温-80溶液，采用无CO2蒸馈水配制；
[0055] 试剂4(250mg):酪氨酸脱羧酶标准品（USP级，0? lU/mg)。
[0056] 以上溶液均采用无CO2双蒸水配制，无CO2双蒸水的制作方法：临用前将双蒸水加 热至沸腾后，继续加热5min，冷却后密封待用。
[0057] 表1快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法的试剂配方
[0058]
【权利要求】
1. 一种快速定量检测氨基酸脱羧酶的比色方法，其具体步骤如下： (1) 反应液与显色液试剂组成及配制 反应液：即配即用，将试剂2溶于试剂1中即可； 试剂 1 :50 mmol/L Tris, pH7. 5,10 mmol /T, MgCl2, 2mmol/LPEP 单环已胺盐，5 mmol /T, 氨基酸； 所述的氨基酸为待检测的氨基酸脱羧酶对应的氨基酸； 试剂2 :5 U/mg PEP羧化酶； 显色液：试剂3 :50 mg/ml固紫B，1%吐温-80溶液，采用无C02蒸馏水配制； 试剂4 :脱羧酶标准品 以上溶液均采用无C02双蒸水配制； (2) 标准曲线试剂配制 将脱羧酶标准品配制成 〇,〇? 〇〇l，〇. 002,0. 003,0. 004,0. 005,0. 006,0. 007,0. 008 U/ U L浓度梯度的酶溶液，溶剂为匀浆介质； pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠 溶液； (3) 标准曲线的制备 ① 移取450 ii L反应液到离心管； ② 加入50 y L步骤（2)中配制的标准品，上下颠倒数次，混匀； ③ 37°C下孵育1 h，每隔10 min上下颠倒混匀数次； ④ 加入25 yL显色液与反应体系中，上下颠倒数次，混匀； ⑤ 静置5 min，l cm光径，蒸馏水调零，520 nm，测各管吸光度（0D)值； ⑥ 重复实验步骤①至⑤9次； ⑦ 构建标准曲线：纵坐标（Y轴）为吸光单位的实际读数；横坐标（X轴）为标准脱羧酶 酶活力单位（U)，为标准品酶浓度X 50 y L ; (4) 待测样品测定方法 ① 移取450 ii L反应液到离心管； ② 向离心管中加入50 ii L待测样品或50 ii L匀浆介质；上下颠倒数次，混匀； ③ 37°C下孵育1 h，每隔10 min上下颠倒混匀数次；加入25 yL显色液于反应体系 中，上下颠倒数次，混匀； ④ 静置5 min，l cm光径，蒸馏水调零，520 nm，测各管吸光值0D; ⑤ 根据〇D@和标准曲线计算样品对应的酶浓度U/y L，与曲线x的值的对 应关系为：E实际=x / 50 ; ⑥ 计算样品比活力：E#S=E@X样品稀释倍数+样品总蛋白浓度。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述的匀浆介质的配方为：pH 7.4,0.01mol/L Tris-Hcl，0. 0001mol/L EDTA-2Na，0. 01mol/L 蔗糖，0? 8% 的氯化钠溶液。
3. 根据权利要求1所述的方法，所述的待测溶液，其制备方法如下： 对于微生物溶液样品，10000 rpm，离心5 min,倾去上清，用生理盐水或PBS反复清洗沉 淀2?3次，再10000 rpm，离心5 min,倾尽上清，用生理盐水稀释至0.8 0D，取10 mL，10000 rpm，离心5 min，倾尽上清，加入500 iiL匀浆介质或生理盐水，将离心管插入冰中，用振幅 30微米超声处理20 s，置于冰上冷却，反复超声处理3次，使细胞破碎，放进4°C台式离心 机15 min，速度为16000 g，小心移去500 yL上清液到新的预冷的1.5 mL离心管置于冰 槽里，检测总蛋白含量待用； 对于动物组织样品，称取组织样品1 g于4°C稳定后的冰生理盐水或PBS缓冲液反复漂 洗2~3次，每次不得低于5 mL，除尽血液等杂质，滤纸吸干，再次称重，置于10 mL离心管中 插入冰中待用；将组织样本放入10 mL离心管中，用移液枪取预冷的匀浆介质，匀浆介质的 体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液枪取总量2/3的匀浆介质或者生理盐水于离心 管中，用干净预冷的剪刀将组织块剪碎入离心管中，用组织匀浆机10000~15000 rpm上下研 磨成10%的组织匀浆，匀浆10 s/次，间歇30 s，连续:T5次，整个过程需要在冰水中进行直 至研磨均匀，最后将剩余的1/3匀浆介质冲洗匀浆机刀口，液体收集于匀浆用的离心管中； 制备好的10%勻楽用低温低速离心机2000 rpm左右离心10~15 min,小心的移取上清液分 装于预冷的1.5 mL离心管中，检测总蛋白含量待用。
【文档编号】G01N21/31GK104374768SQ201410444552
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】唐志如, 邓欢, 孙志洪, 石宝石 申请人:西南大学