糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物的制作方法

糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种能比过去更精准地检测肝病的糖链标志物糖蛋白的测定方法。本发明提供一种能比过去更精准地检测肝病的肝病检查方法。本发明提供一种用于上述测定方法的糖蛋白定量用试剂。本发明还提供一种能够根据肝病病情发展区别肝病病情的肝病病情指标糖链标志物糖蛋白。本发明提供的糖蛋白测定方法是对采自受检者的试样中所含α-1-酸性糖蛋白(AGP)和Mac-2-结合蛋白（M2BP）至少其中之一的糖蛋白进行测定，当糖蛋白为AGP时，测定与选自AOL和MAL的第一凝集素结合的AGP，当糖蛋白为M2BP时，测定与选自WFA、BPL、AAL、RCA120和TJA-II的第二凝集素结合的M2BP。
【专利说明】糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物
[0001] 本申请是申请号为201080040972. 3、申请日为2010年7月14日、名称为"糖蛋白 质的测定方法、肝病的检查方法、糖蛋白质定量用试剂及肝病病情指标糖链标记糖蛋白质" 的由同一 申请人:提交的中国发明专利申请的分案申请。
[0002]

【技术领域】： 本发明涉及以下内容：选自a-1-酸性糖蛋白（AGP)和Mac-2-结合蛋白（M2BP)中至 少其中之一的糖蛋白测定方法；使用了选自AGP和M2BP中至少一种糖蛋白的肝病的检查方 法；以及能够根据糖链的不同检测出基础肝病（underlying liver)状态，即检测出肝细胞 癌和炎症、纤维化等的糖链标记物糖蛋白。
[0003]

【背景技术】： 肝癌大致可以分为在肝脏发生的原发性肝癌和转移性肝癌，普遍认为，原发性肝癌的 90%都是肝细胞癌。
[0004] 在肝细胞癌患者的基础疾病中，大多是感染C型肝炎病毒或B型肝炎病毒，并从急 性病毒性肝炎转为慢性病毒性肝炎、肝硬化，大多数情况下，从患病毒性肝炎起，再经过很 长一段时间才会发生癌变。在肝硬化中，由于炎症和再生会反复进行，所以正常肝细胞减 少，从而变为由纤维组织构成的器官。如，仅日本就有300万的C型肝炎患者，在中国和 非洲据说有1000多万人。B型和C型肝炎患者从慢性肝炎转为癌症的比率如下：轻度慢性 肝炎（Fl)的年率为0. 8%，中度慢性肝炎（F2)的年率为0. 9%，而重度慢性肝炎（F3)的年率 达到3. 5%，肝硬化（F4)转为癌症的概率则上升为年率7% (图1、2)。患肝病时，随着病情的 发展，组织学图像会发生变化（图3)，如首先在慢性肝炎中，肝功能开始消失，然后，在肝硬 化中出现病态结构，肝脏逐渐纤维化等。
[0005] 在癌症治疗中，癌症的早期发现非常重要，在肝细胞癌中也是同样，早期发现癌症 对治疗和术后预后有很大影响。进行了肝切除治疗后的5年存活率在I期为80%，在IV期 则不过38%。
[0006] 迄今为止已知的肝癌标记物有甲胎蛋白（AFP)和通过维生素K缺乏或拮抗剂II诱 导的蛋白质（PIVKA-II)(专利文件1、2)，但其特异性和灵敏性都不够。因此，现在为了尽早 发现肝癌，在检查和诊断中往往使用肝癌标记物、以及超声波检查、计算机断层摄影（CT)、 核磁共振成像法（MRI)等图像检查。
[0007] 非专利文件1所记述的内容中做了以下尝试：用AAL凝集素测定血清中的岩藻糖 基化AGP，检测出肝硬化。然而，从其表2所述结果可以看出，在非专利文件1中的技术中， 灵敏性为66%左右，特异性为87%，正确诊断率为77%左右，其肝病检测功能不能令人十分满 〇
[0008] 非专利文件2中记述有如下实验：通过使用RCA凝集素的免疫色谱法，测定健康 人、急性肝炎患者、慢性肝炎患者、肝硬化患者和肝细胞癌患者的血清中的缺乏唾液酸基的 AGP (asialo AGP)，以验证能否对各种肝病作出阳性判断。然而，从其表2所述结果可以看 出，非专利文件2中的技术中，肝硬化的灵敏度为88%左右，但是慢性肝炎患者中的假阳性 率达到了 63%，从肝病检测功能上来看不能令人满意。
[0009] 在先技术文献 专利文件 专利文件1 :特开平10-26622号 专利文件2 :特开平8-184594号。
[0010] 非专利文件 非专利文件I :Ingvar Ryden等，a 1-酸性糖蛋白岩藻糖基化在接受肝活检患者中 的肝硬化诊断准确性，《临床化学》48:12, 2195-2201 (2002) (Diagnostic Accuracy of a I-Acid Glycoprotein Fcosylation for Liver Cirrhosis in Patients Undergoing Hepatic Biopsy，Clinical Chemistry 48:12,2195-2201 (2002)) 非专利文件2 :Eun Young Lee等，用于检测肝病患者的血清缺乏唾液酸基的a I-酸 性糖蛋白的快速免疫色谱法试纸的进展，《免疫法杂志》，308 (2006) 116-123 (Development of a rapid, immunochromatographic strip test for serum asialo a 1-acid glycoprotein in patients with hepatic disease, Journal of Immunological Methods 308(2006) 116-123)。
[0011]


【发明内容】
： 发明要解决的课题 本发明的课题在于：提供一种能够比过去更精准地检测肝病的糖链标记物糖蛋白的测 定方法。本发明的课题在于：提供一种能够比过去更精准地检测肝病的肝病检查方法。本 发明的课题在于：提供一种用于上述测定方法的糖蛋白定量用试剂。本发明的课题还在于： 提供一种肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，该糖链标记物糖蛋白能够区分开与肝病的进展 情况相应的肝病病情。
[0012] 解决课题的手段 选自以下物质中的至少一种的糖蛋白测定方法，其中上述物质为采自受检者的试样中 所含a-1-酸性糖蛋白（AGP)和Mac-2-结合蛋白（M2BP)，在该糖蛋白测定方法中，当糖蛋 白为AGP时，测定与第一凝集素结合的AGP，其中所述第一凝集素选自AOL和MAL，当糖蛋白 为M2BP时，测定与第二凝集素结合的M2BP，其中所述第二凝集素选自WFA、BPL、AAL、RCA120 和 TJAII。
[0013] 发明的效果 用本发明的测定方法可以简便地测定糖链标记物糖蛋白，其中该糖链标记物糖蛋白能 够高可信度地检查肝硬化等肝病。
[0014] 用本发明的肝病病情指标糖链标记物糖蛋白所进行的检查中，其正确诊断率比现 有的标记物高，且用微量血清即可检查，通过本发明的肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，不 仅能监视肝纤维化的进展情况，把握病情发展，还能够对进行了干扰素等抗病毒疗法后的 肝纤维化和炎症的改善进行评估。

【专利附图】

【附图说明】 [0015] ：
[图1]显示的是从感染C型肝炎到患肝细胞癌的时间推移和肝状态的变化；
[图2]为由慢性肝炎转为肝细胞癌的比率的示图；
[图3]为肝硬化转为肝细胞癌的比率示图；
[图4]为基础肝组织的变化与患癌的关系图；
[图5]为从感染到患癌的肝结构变化的示图；
[图6]显示的是肝的状态变化与诊断治疗方案的关系；
[图7]为以凝集素微阵列为基础的生物标记物候选分子的验证实验的步骤流程图； [图8]是一张结果图，其显示的是通过抗体铺覆凝集素微阵列对肝病病情指标标记物 糖蛋白之一的a 1酸性糖蛋白（AGP)进行比较糖链分析的结果；
[图9]是一张结果图，其显示的是通过抗体铺覆凝集素微阵列，对肝病病情指标标记 物糖蛋白之一的90K/Mac-2-结合蛋白（M2BP)进行比较糖链分析的结果；
[图10]的附图显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及通过AGP的 抗体铺覆凝集素阵列分析获得的凝集素信号强度变化；
[图11]显示的是：根据肝病病情指标糖链标记物，即AGP的抗体铺覆凝集素微阵列分 析而制定的肝硬化检测方案；
[图12]是将AGP作为能够监视肝脏的纤维化进展的标记物的干扰素的治疗的效果判 断图；
[图13]为在第一快速测定法中使用DSA时的稀释线性示意图；
[图14]为在第一快速测定法中使用ML时的稀释线性示意图；
[图15]为在第一快速测定法中使用AOL时的稀释线性示意图；
[图16]为在第一快速测定法中，对市场出售的样本使用MAL时的测定结果示意图； [图17]为在第一快速测定法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图； [图18]为在凝集素阵列法中，对市场出售的样本使用ML时的测定结果示意图；
[图19]为在凝集素阵列法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图20]为在第二快速测定法中使用DSA时的稀释线性示意图；
[图21]为在第二快速测定法中使用ML时的稀释线性示意图；
[图22]为在第二快速测定法中使用AOL时的稀释线性示意图；
[图23]为在第二快速测定法中，对市场出售的样本使用MAL时的测定结果示意图； [图24]为在第二快速测定法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图； [图25]为在第二快速测定法中对临床样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图26]为在第二快速测定法中对临床样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图27]为在凝集素阵列法中对临床样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图28]为在凝集素阵列法中对临床样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图29]是以125例HCV感染患者的血清为对象，用第二快速测定法进行测定后的结果 示意图；
[图30]是以100例健康者的样本为对象，用凝集素阵列法和第二快速测定法进行测定 后的结果的比较图；
[图31]的附图显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及通过M2BP 的抗体铺覆凝集素阵列分析获得的凝集素信号强度的变化；
[图32]为肝细胞癌患者术前术后的血清中M2BP上糖链变化的示图；
[图33]为检测WFA结合性M2BP的最佳方式，即凝集素-抗体三明治型ELISA的模型 图；
[图34]为肝癌症患者术后血清中WFA结合性M2BP量的随时间变化的示意图；
[图35]显示的是用ELISA检测WFA结合性M2BP时，样本加热处理的有无对检测灵敏 性的影响；
[图36]显示的是在用第二快速测定法测定M2BP时，在以HepG2培养细胞的上清为试 样的情况下，使用WFA进行测定的稀释线性示意图；
[图37]显示的是在用第二快速测定法测定M2BP时，在以重组人半乳糖凝集素-3BP (Recombinant Human Galectin-3BP)/MAC_2BP为试样的情况下，使用WFA进行测定的稀释 线性示意图。
[0016]

【具体实施方式】： 1.慢性肝病的现状 1-1.肝病的病情 人在感染B型肝炎病毒或C型肝炎病毒后，从急性期炎症开始，经过5-15年会发展为 慢性期炎症。特别是进入慢性期的C型肝炎很少自愈，肝功能会逐渐降低，直至肝硬化。图 1显示的是从感染C型肝炎起，直到发展为肝细胞癌的时间推移与肝状态的变化。为了定义 从慢性肝炎到肝硬化的病情，从病理形态学角度捕捉肝脏的格利森区域（Glisson)和肝小 叶的纤维性变化，并将其分类为轻度（Fl)、中度（F2 )、重度（F3 )和肝硬化期（F4)。纤维化进 展与肝细胞癌患癌风险的上升之间存在关联，如图2所示，Fl或2的年率为1%以下，与此 相对应，F3中上升到每年3-4%。在对纤维化程度进一步发展的组织学图像进行确认，并诊 断为肝硬化的（F4)中，如图3所示，肝细胞癌出现的概率为年率7%。因此，为了有效发现并 治疗肝细胞癌，重要的是简便地甄别出处于F3及F4状态的患者，并将其作为精密检查的对 象进行跟踪。
[0017] 在日本的B型肝炎和C型肝炎患者医疗补助事业中，主要针对的对象是：在肝活检 标本的病理组织学诊断中，判断为纤维化程度为F1-3的患者。当诊断为F4时，将其归类为 肝硬化，在干扰素治疗的B型肝炎和C型肝炎患者医疗补助事业中，仅有其中的一部分成为 补助对象，无法取得满意的治疗结果。
[0018] 1-2.对于抗病毒疗法控制纤维化进行评估 慢性C型肝炎适用于PEG-IFN+RBV疗法，C型肝炎硬化代偿期则适合单独用干扰素治 疗。另一方面，B型肝炎(慢性肝炎、肝硬化）的治疗中主要使用核酸类似物，因此必须有炎 症和纤维化评估标记物。尤其是血清生物标记物有望广泛应用于临床诊断和评估。
[0019] 1-3?肝细胞癌 一般认为，患肝细胞癌是由于以下两种因子活跃地交互作用所致：B型肝炎病毒或C型 肝炎病毒感染所产生的微生物学因子、以及环境因子。在日本，已知肝细胞癌患者的约9成 感染过B型肝炎或C型肝炎病毒，肝细胞癌患者的约9成出现在慢性肝炎和肝硬化患者中。 据认为，肝细胞癌的癌变危险因子中，除病毒以外，还有男性、高龄、大量饮酒、抽烟、以及毒 枝菌素中的黄曲霉毒素等。（肝癌诊疗指南，（财）国际医学情报中心)。
[0020] 1-4.肝细胞癌的早期诊断 目前，肝细胞癌的发现主要靠以下方法：测定受检者血清样本中的AFP和PIVKA-II等 肝癌标记物、以及以超声波检查（回声检查)为中心的图像诊断。在图像诊断中，通常将超声 波检查或CT作为初次检查，这些检查中发现某种异常时，再做MRI和血管造影。
[0021] 1-5.从预防肝细胞癌的观点出发，筛选癌症高危人群 在日本，肝细胞癌患者的约9成来自于感染B型肝炎病毒或C型肝炎病毒的肝炎患者， 可以以病毒感染和肝功能下降为指标，筛选成为精密检查的对象的患者。
[0022] 然而，即使是肝细胞癌以7%的年率出现的肝硬化（F4)患者，为早期发现并治疗癌 症，需要每隔三个月进行一次高额的高侵袭性精密检查，不得不说，这对患者的经济和身体 都是很大的负担。每年癌变率为3-4%的F3更是如此。此外，考虑到通过干扰素治疗C型 肝炎病毒的成功率只有5成左右，就更需要对众多干扰素治疗未奏效的慢性肝炎患者进行 临床跟踪，明确其处于肝硬化和肝细胞癌进程中的哪个阶段。即在目前的肝炎到肝细胞癌 的疾病治疗中，需要通过血液检查等简易的检查，权衡肝炎到肝硬化患者的癌变风险，并进 行与之相应的肝细胞癌的诊断治疗。
[0023] 在临床病理学上，纤维化程度与肝硬化和肝细胞癌的风险之间存在着相关性，这 一点入手，我们发现，开发出一种能够以血清学方式定量测定纤维化进展的检查技术，便可 以解决上述问题。如图4所示，肝脏中的C型肝炎病毒感染会引起受损肝细胞的再生，以及 切口修复，即纤维化。随着肝脏纤维化的发展，患癌的风险升高，因此，"纤维化程度"是一项 向癌症发展的指标。在出现癌的基础肝组织中，由于结构细胞发生变化，因此可以预测到， 伴随着纤维化的发展会发生糖链变化。如图5所示，从感染起逐渐发展成癌症，此时，可以 观察到肝丧失了其正常结构和功能的常规活性，同时出现了以纤维化为特征的病态结构。 已知在肝细胞癌中，早期肝细胞癌发展为典型肝细胞癌，细胞特性发生变化，超过2cm后， 早期肝细胞癌中就会出现典型肝细胞癌。图6显示了肝的状态变化与诊治方案的关系。对 于慢性肝炎采用的是聚乙二醇干扰素和病毒唑并用疗法（PEG-IFN+RBV疗法)，对于早期肝 细胞癌采用的是无线电频率烧灼术（RFA)。对肝硬化没有诊断检查法及有效的治疗方法。 本发明的糖链标记物糖蛋白能够区分慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌，因此是肝硬化的新治 疗方法的开发中的一项指标。此外，将其与FibroScan共用，有望对纤维化进行定量评估， 因此也能够用糖链标记物糖蛋白圈定纤维化（F3-F4)病例。除了纤维化的定量诊断外，在 以抑制肝纤维化的发展和癌变为目的的治疗中，也有望临床导入该成果，并将其作为治疗 效果的血清评估标记物使用。
[0024] 2.新肝病病情指标糖链标记物糖蛋白的肝病特异性糖链变化 本发明中的新肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，即AGP和M2BP会产生糖链变化，该糖 链变化使得以下各项具有各自的特征：因病毒感染而引起的疾病在其发生、发展过程中出 现的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。将这种以病毒性肝病的病情发展中所伴随的糖链变化 为指标，能够判断肝病病情的标记物糖蛋白称为肝病病情指标糖链标记物。
[0025] 对本发明的新肝病病情指标糖链标记物，即对AGP和M2BP的糖链变化的检测中， 能反映出病毒性肝病的各种病情的特征，即能够反映出肝细胞癌、肝硬化、肝纤维化（F3和 F4标记物）或慢性肝炎的特征，能够鉴别出上述各种疾病。然而因疾病的种类和进展程度 的不同，这些标记物的糖链变化也会表现为不同的种类和比率。因此，为了充分利用标记 物，并制造出专门针对各个对象的检测试剂盒，就需要从统计学的角度，选择反映疾病特异 性糖链变化的凝集素探针。
[0026] 3.糖链标记物糖蛋白的肝病特异性糖链变化的验证 用后述凝集素阵列验证了 AGP和M2BP上的糖链的疾病特异性变化。最好使用抗体铺 覆凝集素阵列法。根据用凝集素阵列测定上述标记物糖蛋白的结果，研究1)随着病情的进 展，在哪个凝集素信号中看出多少测定值变化，2)测定值的变化在哪个疾病阶段(初期还是 晚期）最明显，3)测定值变化的信息是否有利于疾病的控制，以评估其有用性，验证该标记 物适用于哪种肝病病情。
[0027] 下面将更具体地介以下方法：将糖链标记物糖蛋白用于肝纤维化的进展监视和肝 硬化检测时，如何选择适合的凝集素探针。
[0028] 对于从(病毒性）肝炎患者、肝硬化患者和肝细胞癌患者的血清中采集的糖蛋白 (AGP和M2BP)，用抗体铺覆凝集素阵列法等比较糖链特征。首先，从(病毒性）肝炎患者、慢 性肝炎、肝硬化患者和肝细胞癌患者采集血样。在采集的各个血样中，分别用抗体对AGP和 M2BP进行免疫沉降，浓缩提纯，用抗体铺覆凝集素阵列确认了可以将其作为肝病病情的糖 链标记物糖蛋白使用。更具体而言，如图7所示，以肝炎病毒感染者的血清为对象，就AGP和 M2BP进行比较糖链分析。通过使用抗AGP抗体和抗M2BP抗体的免疫沉降法，可以分别简 单地对AGP和M2BP进行浓缩。凝集素微阵列是高灵敏性的比较糖链分析装置，有100纳克 的蛋白质制备量就足够进行分析，因此，可以以小规模进行上述前处理。将浓缩后的AGP和 M2BP迅速地添加到凝集素微阵列中，反应一定时间后，通过抗体铺覆凝集素微阵列法，获得 AGP和M2BP的糖链探针。此时，添加到凝集素阵列中的蛋白质的量因蛋白质而不同，大概 从1纳克到数十纳克。只对统计分析所需数量的样本进行阵列分析，然后，用其数据集进行 T检验（Student-T test)等二群比较分析。以此，可以客观地选择出随病情变化而在信号 上产生显著性差异（significant difference)的凝集素。凝集素微阵列比如可以使用固化 多个凝集素的凝集素微阵列，其中所述多个凝集素包含下面的表2所述凝集素的部分或全 部，更具体而言，可以使用Kuno A?等，《自然方法学》（Nat. Methods) 2,851-856(2005) 中所记述的凝集素微阵列或GP生物科学公司生产的LecChip。抗体可以使用表1所列抗体
[表1]

【权利要求】
1. 一种用于测定采自受检者的试样中所含a-1-酸性糖蛋白（AGP)的AGP定量用试 齐U，其特征在于，该AGP定量用试剂具有以下物质：固定有选自AOL和MAL中的凝集素的磁 性粒子、以及标记抗AGP抗体。
2. 根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，该试剂包括固定有AOL的磁性粒 子和固定有MAL的磁性粒子。
3. 根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标记抗AGP抗体的标记物是 经过去糖基处理的碱性磷酸酶。
4. 根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标记抗AGP抗体的抗AGP抗 体是经过去糖基处理的抗AGP抗体。
5. 根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，还具有反应性不随AGP的糖链结 构变化而变化的标准化用凝集素。
6. 根据权利要求5所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标准化用凝集素是DSA。
7. 根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，该试剂包括固定有DSA的磁性粒 子。
8. -种肝病病情指标糖链标记物，该标记物由具有肝病特异性糖链变化、且与选自 AOL和MAL中的凝集素结合了的a -1-酸性糖蛋白（AGP)构成。
【文档编号】G01N33/68GK104374919SQ201410474611
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2010年7月14日 优先权日:2009年7月14日
【发明者】成松久, 池原让, 久野敦, 曾我部万纪, 田中靖人, 沟上雅史, 伊藤清显, 松原俊介, 鹤野亲是, 高浜洋一, 香川孝司, 永井慎也 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所, 公立大学法人名古屋市立大学, 独立行政法人国立国际医疗研究中心, 希森美康株式会社