一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素a的超灵敏检测方法
【专利摘要】一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的超灵敏检测方法，属于分析化学领域。本发明主要工艺步骤为：（1）35nm粒径的金纳米粒子的合成，（2）8nm粒径的银纳米粒子的合成，（3）金纳米粒子上适配体的修饰，（4）银纳米粒子上适配体部分互补序列的修饰，（5）金核银卫星结构的组装，（6）圆二色谱检测，建立金银手性信号叠加与赭曲霉毒素A的浓度的标准曲线。本发明提供了一种用金核银卫星结构的手性信号检测赭曲霉毒素A的方法，与传统检测方法相比成本低，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。
【专利说明】—种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的超灵敏检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于金核-银卫星手性结构组装的赭曲霉毒素A的超灵敏检测方法，属于分析化学领域。
【背景技术】
[0002]赫曲霉毒素A由抚抱青霉囷株、广紫青霉囷、圆弧青霉囷株广生，在霉变谷物、词料等最常见。动物摄入霉变的饲料后，肉制品中就可能含这种毒素。赭曲霉毒素A主要对动物肝脏与肾脏有很强的毒害作用，可以引起肾脏损伤。大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。动物试验中观察到它还存在致畸作用。
[0003]传统的赭曲霉毒素A (OTA)的检测方法主要基于仪器，如液质联用、高效液相色谱等，检测成本很高，并且对操作人员的操作技能有很高的要求。酶联免疫检测则对单克隆抗体的要求很高，而单抗的制备和筛选是一项繁重且高耗的任务。电化学和荧光等新型检测方法也逐渐被人们开发出来。电化学对样品的基质要求较高，而荧光检测需要昂贵的荧光素来制备荧光探针。所以，本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于纳米材料的自组装技术构建了具有强手性的金核银卫星纳米结构，并以此作为检测基底。
[0004]通过DNA杂交将大粒径的金纳米粒子和小粒径的银纳米粒子组装成具有强手性的核卫星结构。目标物和适配体部分互补序列(OTA-C)修饰的银纳米粒子与适配体(OTA-aptamer)修饰的金纳米粒子竞争结合，目标物浓度越大，核卫星结构组装的越不完全，手性信号越弱。将手性信号与目标物的浓度建立标准曲线，以此来定量检测赭曲霉毒素A0
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的超灵敏检测方法。
[0006]本发明的技术方案:一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的检测方法:
(一)检测传感器的构建
(1)35 nm粒径的金纳米粒子的合成
35 nm粒径的金纳米粒子采用种子生长法合成。
[0007]13 nm的金种子采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法合成:反应用的锥形瓶提前用新配制的王水浸泡24h，用超纯水冲洗至洁净，37°C烘干待用。2mL 1mM的氯金酸、38mL超纯水加入洁净的锥形瓶内，加热至沸腾，加入2mL 38.8mM的柠檬酸三钠，煮沸20min得到13nm粒径的金种子。
[0008]35nm粒径金纳米粒子的合成:锥形瓶中加入2mL 1mM的氯金酸、0.1mL 1mM的硝酸银、42.5mL超纯水、2mL上述13nm粒径的金种子，在搅拌状态下加7.5mL 5.3mM的抗坏血酸溶液以30mL/h的速度泵入，得到直径35nm的金纳米粒子。
[0009](2)8 nm粒径的银纳米粒子的合成
锥形瓶的处理同上。锥形瓶中加入超纯水20mL、l%PVP 5mL、0.1M硼氢化钠(新配)0.6mL,冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，5mL IM的硝酸银溶液，反应后的溶液80°C水浴老化3h，冷却后放4°C冰箱待用。
[0010](3)金纳米粒子上适配体(OTA-aptamer)的修饰
35 nm粒径的金纳米粒子离心浓缩10倍后用1mM pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬，加入巯基化的OTA-aptamer使得终浓度为5 μ M。DNA与金纳米粒子的摩尔比为300: I。室温孵育2h后加NaCl至50mM，之后每隔Ih加一次NaCl，至NaCl终浓度300mM。溶液老化24h后离心3次去除未结合的DNA，1mM Tris-HCl重悬待用；
OTA-aptamer: 5’ -SH-TTTTTTTTTT GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-3’ ；
(4)银纳米粒子上适配体部分互补序列(OTA-C)的修饰
采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为8nm的银纳米粒子；银纳米粒子离心浓缩10倍用1mM pH8的Tris-HCl重悬，加入OTA的巯基化部分互补序列OTA-C使得终浓度为0.5 μ M，室温孵育过夜；OTA-C与银纳米粒子的摩尔比为5: I ;离心去除未结合的DNA，用Tris-HCl重悬待用。
[0011]OTA-C: 5’ -SH- TTTTTTTTTT CCGATGCTCC CT-3’ ；
(5)金核-银卫星结构的组装
30 μ L OTA-aptamer适配体修饰的金纳米粒子与150 μ L 0TA-C适配体部分互补序列修饰的银纳米粒子混合，室温孵育8h，得金核-银卫星结构的组装体混合液；
(二)圆二色谱检测，建立金银手性信号叠加与赭曲霉毒素A的浓度的标准曲线六个不同浓度的赭曲霉毒素A标准品:0，10，20，100，200，500 pg/mL溶在水中；20yL标准品溶液与ISOyL步骤(3)的金核-银卫星结构的组装体混合液混合，室温孵育8h ；
反应结束后测圆二色谱(⑶)，以Σ⑶(⑶400 nm +⑶527 nm)为信号建立与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，Σ CD为纵坐标。
[0012]本发明的有益效果:本发明提供了一种基于圆二色谱来检测赭曲霉毒素A的方法，与传统的检测手段相比，具有灵敏度高、检测限低、方便、快捷的优点，有着非常好的实际应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1本发明通过核酸杂交形成的金核-银卫星手性组装体的透射电镜照片。
[0014]图2本发明中向金核-银卫星手性组装体中加入不同浓度的赭曲霉毒素A，导致的CD光谱的变化图。
[0015]图3本发明中的圆二色谱检测赭曲霉毒素A的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
(一)检测传感器的构建
(1)35 nm粒径的金纳米粒子的合成 35 nm粒径的金纳米粒子采用种子生长法合成。
[0017]13 nm的金种子采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法合成:反应用的锥形瓶提前用新配制的王水浸泡24h，用超纯水冲洗至洁净，37°C烘干待用。2mL 1mM的氯金酸、38mL超纯水加入洁净的锥形瓶内，加热至沸腾，加入2mL 38.8mM的柠檬酸三钠，煮沸20min得到13nm粒径的金种子。
[0018]35nm粒径金纳米粒子的合成:锥形瓶中加入2mL 1mM的氯金酸、0.1mL 1mM的硝酸银、42.5mL超纯水、2mL上述13nm粒径的金种子，在搅拌状态下加7.5mL 5.3mM的抗坏血酸溶液以30mL/h的速度泵入，得到直径35nm的金纳米粒子。
[0019](2)8 nm粒径的银纳米粒子的合成
锥形瓶的处理同上。锥形瓶中加入超纯水20mL、l%PVP 5mL、0.1M硼氢化钠(新配)0.6mL,冰浴搅拌状态下以30mL/h的速度泵入5mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP，5mL IM的硝酸银溶液。反应后的溶液80°C水浴老化3h。冷却后放4°C冰箱待用。
[0020](3)金纳米粒子上适配体(OTA-aptamer)的修饰
35 nm粒径的金纳米粒子离心浓缩10倍后用1mM pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬，加入巯基化的OTA-aptamer使得终浓度为5μ M ;DNA与金纳米粒子的摩尔比为300: I。室温孵育2h后加NaCl至50mM，之后每隔Ih加一次NaCl，至NaCl终浓度300mM。溶液老化24h后离心3次去除未结合的DNA，1mM Tris-HCl重悬待用
OTA-aptamer: 5’ -SH-TTTTTTTTTT GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-3’ ；
(4)银纳米粒子上适配体部分互补序列(OTA-C)的修饰
采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为8nm的银纳米粒子；银纳米粒子离心浓缩10倍用1mM pH8的Tris-HCl重悬，加入OTA的巯基化部分互补序列OTA-C使得终浓度为
0.5 μ M，室温孵育过夜；0TA-C与银纳米粒子的摩尔比为5: I ;离心去除未结合的DNA，用Tris-HCl重悬待用。
[0021]OTA-C: 5’ -SH- TTTTTTTTTT CCGATGCTCC CT-3’ ；
(5)金核-银卫星结构的组装
30 μ L OTA-aptamer适配体修饰的金纳米粒子与150 μ LOTA-C适配体部分互补序列修饰的银纳米粒子混合，室温孵育8h，得金核-银卫星结构的组装体混合液。
[0022](二)圆二色谱检测，建立金银手性信号叠加与赭曲霉毒素A的浓度的标准曲线六个不同浓度的赭曲霉毒素A标准品:0，10，20，100，200，500 pg/mL溶在水中。20 μ L
标准品溶液与ISOyL步骤(3)的金核-银卫星结构的组装体混合液混合，室温孵育8h。
[0023]反应结束后测圆二色谱(⑶)，以Σ⑶(Σ⑶=⑶400 nm +⑶527 nm)为信号建立与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，Σ CD为纵坐标。
【权利要求】
1.一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的检测方法: (一)检测传感器的构建 (1)金纳米粒子上修饰适配体OTA-aptamer . 35 nm粒径的金纳米粒子采用13 nm的金种子生长合成；35 nm粒径的金纳米粒子离心浓缩10倍后用1mM pH7.2的磷酸盐缓冲液重悬，加入巯基化的OTA-aptamer使得终浓度为5yM;DNA与金纳米粒子的摩尔比为300: 1，室温孵育2h后加NaCl至50mM，之后每隔Ih加一次NaCl，至NaCl终浓度300mM ;溶液老化24h后离心3次去除未结合的DNA，1mMTris-HCl重悬待用；
OTA-aptamer: 5’ -SH-TTTTTTTTTT GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-3’ ； (2)银纳米粒子上修饰适配体部分互补序列OTA-C 采用硼氢化钠还原硝酸银的方法合成粒径为8nm的银纳米粒子；银纳米粒子离心浓缩10倍用1mM pH8的Tris-HCl重悬，加入OTA的巯基化部分互补序列OTA-C使得终浓度为.0.5 μ M，室温孵育过夜；0TA-C与银纳米粒子的摩尔比为5: I ;离心去除未结合的DNA，用Tris-HCl重悬待用；
OTA-C:5’ -SH- TTTTTTTTTT CCGATGCTCC CT-3，； (3)金核-银卫星结构的组装 . 30 μ L OTA-aptamer适配体修饰的金纳米粒子与150 μ L OTA-C适配体部分互补序列修饰的银纳米粒子混合，室温孵育8h，得金核-银卫星结构的组装体混合液； (二)圆二色谱检测，建立金银手性叠加信号与赭曲霉毒素A的浓度的标准曲线 六个不同浓度的赭曲霉毒素A标准品:0，10，20，100，200，500 pg/mL溶在水中；20yL标准品溶液与ISOyL步骤(3)的金核-银卫星结构的组装体混合液混合，室温孵育8h ； 反应结束后测圆二色谱⑶，Σ⑶=⑶400 nm +⑶527 nm,以Σ⑶为信号建立与赭曲霉毒素A浓度的标准曲线，赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，Σ CD为纵坐标。
【文档编号】G01N21/19GK104237136SQ201410510264
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】徐丽广, 赵雪利, 胥传来, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学