测定铁-碳水化合物络合物中不稳定铁含量的方法
【专利摘要】本发明提供了一种测定铁-碳水化合物络合物中不稳定铁含量的方法，包括步骤：使铁-碳水络合物与人血清接触，将与人血清结合的不稳定铁还原为二价铁；将还原得到的二价铁与显色剂作用生成有色化合物，测量有色化合物的吸光度；与经过同样还原及显色反应处理的铁标准液进行比较，计算得到铁-碳水络合物中不稳定铁的含量。本发明方法的检测灵敏度高、精密度好，准确度高，能够快速、准确、定量地测定铁-碳水化合物中不稳定铁含量，可以对(尤其是静脉)铁补充制剂的质量进行科学和有效的控制，保障临床用药的安全。
【专利说明】测定铁-碳水化合物络合物中不稳定铁含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及铁补充制剂的分析方法，具体涉及一种测定铁-碳水化合物络合物中 不稳定铁（III)含量的方法。
【背景技术】
[0002] 铁元素是人体必不可少的微量元素之一，是构成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素和 多种氧化酶的重要成分，作为氧的载体，保证机体组织内氧的正常输送。
[0003] 铁在许多组织细胞被吸收或摄取都是通过经典的转铁蛋白（transferrin, Tf)和 转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR)的途径，即三价铁首先与Tf结合，两者的结合 物再与细胞表面的TfR结合，之后经过内吞、酸化、释放和移位等步骤，铁进入胞浆，最终被 细胞利用，合成血红蛋白及其他物质。
[0004] 铁缺乏时不能合成足够的血红蛋白，造成缺铁性贫血。临床上，缺铁性贫血诊断成 立并查明病因后应立即给予补铁治疗。一般情况下，口服铁剂为首选，但口服铁剂常引发明 显的胃肠道不适，有报道称近1/5的病人因此而中断治疗。口服铁剂还受到食物成分的干 扰以及体内铁储备的影响，尤其是许多慢性病、肾脏疾病、心脏病和肿瘤患者，铁的吸收和 利用也会受到影响。对于这部分患者，临床医生应考虑给予静脉补铁。此外，缺铁性贫血伴 胃肠道疾病患者需要快速恢复体内铁贮备而口服不足以达到这一目标时，也可将静脉补铁 作为首选。
[0005] 目前国内外已研制出多种含有铁-碳水化合物络合物的铁补充静脉注射制剂，包 括葡萄糖酸铁钠注射剂、蔗糖铁注射液、注射用蔗糖铁、右旋糖酐铁注射液、山梨醇铁注射 液等。以葡萄糖酸铁钠注射剂为例，它是一种葡萄糖酸铁钠复合物制备的胶体混悬液并作 为前药使用，其中葡萄糖酸铁钠复合物包含与葡萄糖酸络合的胶体氢氧化铁颗粒（铁核）。 这些铁核通过将氯化铁用碱中和值PH为2获得，在该pH下饱和氢氧根离子形成胶体氢氧 化铁，其在形成后与葡萄糖酸原位络合。所得的复合物被网状内皮系统的细胞摄取，释放出 铁离子。铁离子再与转铁蛋白结合，转铁蛋白进而将其转运至骨髓用于红细胞生成或者转 运至铁蛋白和骨髓、脾和肝中的的铁贮存部位。一般来说，铁核的结构遵循配位化学。碳水 化合物的羟基替换铁核外表所结合的水分子，从而使碳水化合物与铁核结合。
[0006] 然而，所述铁补充静脉注射制剂中也包含一些与复合物的核心未结合或者弱结合 的铁元素，形成不稳定铁。这些不稳定铁很容易被化学反应或血浆中的络合剂如蛋白所活 化，这会导致铁补充制剂在静脉给药后铁元素的快速释放，即突释作用。不稳定铁的释放可 以使转铁蛋白迅速饱和而造成非转铁蛋白结合铁的出现，而非转铁蛋白结合铁可以催化有 害的氧化应激反应，在临床上引起甚至可能致命的急性不良反应。
[0007] 现有技术公开了铁的四种测定原理：1)亚铁嗪比色法原理：血清铁和运铁蛋白结 合成复合物，在酸性介质中铁从复合物中解离出来，再被还原剂还原成二价铁，并与亚铁嗪 生成紫红色化合物，在波长562nm处有一吸收峰，与同样处理的标准液比较，即可求得血清 铁的含量。2)双联吡啶比色法原理：在酸性条件下使铁从与蛋白质结合状态中游离出来。 用盐酸羟胺作还原剂使血清中三价铁还原成二价铁，后者与双联吡啶显色剂反应生成红色 螫合物，在520nm处比色定量。本法简便快速，但灵敏度差，干扰因素较多，尤以铁质污染最 为严重，溶血也会影响结果。3)菲洛嗪比色法原理：三氯醋酸-盐酸混合液使血清中的铁 从运铁蛋白中释放并使蛋白沉淀，释放出来的三价铁可用硫代乙醇酸还原成二价铁，后者 和菲洛嗪结合成紫红色化合物，吸收峰为562nm。4)血清总铁结合力（TIBC) :在血清样品 中加足量的铁标准液使运铁铁蛋白被铁饱和，过量的铁用MgCO3除出，离心取上清液，按测 血清铁的方法求出铁的含量，即为TIBC.(《生理学》，人民卫生出版社，2012)。然而，上述方 法仅涉及铁含量测定的基本原理，实际在不同条件下对具体物质进行测定时仍会存在较大 偏差。目前还没有关于测定铁静脉制剂中不稳定铁含量方法的报道。因此，有必要开发一 种稳定、可靠的测定静脉铁制剂中不稳定铁含量的方法，并以该方法为基础对铁补充制剂 的质量进行评估。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种测定铁-碳水化合物络合物中不稳定铁含量的方法，特 别用于对含有铁-碳水络合物的制剂，例如静脉铁补充制剂进行体外质量的评价，保障临 床用药的安全。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0010] 一种测定铁-碳水化合物络合物中不稳定三价铁含量的方法，包括步骤：
[0011] 使铁-碳水络合物与人血清接触，将与人血清结合的不稳定三价铁还原为二价 铁；将还原得到的二价铁与显色剂作用生成有色化合物，测量有色化合物的吸光度；与三 价铁标准液经过同样还原及显色反应处理获得的铁浓度-吸光度标准曲线进行比较，计算 得到铁-碳水络合物中不稳定三价铁的含量。
[0012] 所述铁-碳水化合物络合物中不稳定铁为与所述络合物的核心未结合或者弱结 合的三价铁离子。所述弱结合铁为络合物中易于参与化学反应或与其他铁络合物构成组分 反应的铁元素。
[0013] 本发明中，所述的铁-碳水化合物络合物可以溶液形式或者制剂形式存在。所述 的不稳定三价铁可以存在于铁-碳水化合物络合物中，也可以存在于包含铁-碳水化合物 络合物的溶液或制剂中。
[0014] 在一种实施方式中，所述测定铁-碳水化合物络合物中不稳定三价铁含量的方 法，包括步骤：
[0015] 使铁-碳水络合物与人血清混合，在混合的三个以上不同时间点分别获取混合 物，加入蛋白变性剂中止反应，再将与人血清结合的三价铁还原为二价铁；然后将还原得到 的二价铁与显色剂作用生成有色化合物，测得其吸光度，以混合时间为横坐标，吸光度为纵 坐标，得到曲线方程，求得时间为0时的吸光度数值，将该吸光度数值代入由三价铁标准液 经过同样还原及显色反应处理获得的铁浓度-吸光度标准曲线方程，计算得到样品中不稳 定三价铁的含量。
[0016] 在一种实施方式中，所述测定铁-碳水化合物络合物中不稳定三价铁含量的方 法，包括步骤：
[0017] 1)标准曲线的建立：
[0018] 配制三种以上不同浓度的三价铁标准品系列溶液，分别吸取一定量的铁标准品 系列溶液，在酸性介质中还原剂作用下将其还原为二价铁，然后将显色剂与二价铁作用生 成有色化合物，测得吸光度，以三价铁的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方 程；
[0019] 2)铁-碳水络合物样品的处理：
[0020] 将人血清与铁-碳水络合物样品混合进行共孵育，其中所述样品中铁的总含量换 算为人血清铁浓度优选为50?180 μ g/mL，在孵育的三个以上不同时间点分别获取一定量 的样品，加入蛋白变性剂中止反应，在酸性介质中还原剂作用下将与人血清结合的三价铁 还原为二价铁，显色剂与二价铁作用生成有色化合物，测得吸光度，以孵育时间为横坐标， 吸光度为纵坐标，得到曲线方程，求得时间为〇时的吸光度数值，将该吸光度数值代入标准 曲线方程，计算得到铁-碳水络合物样品中不稳定三价铁的含量。
[0021] 上述铁的总含量中的铁为样品中稳定和不稳定铁的总含量；更具体地，为稳定和 不稳定的三价铁的总含量。
[0022] 所述配制三价铁标准液的标准品可以是结晶硫酸铁铵（分子式FeNH4(SO 4)2 " 12H20)。所述三价铁标准品系列溶液的浓度可以是0. 1?100 μ g/ml，优选5?80 μ g/ml， 例如5、10、20、30、40、50、60、70、8(^8/1111以及上述范围内的其他数值。铁标准品系列标准 液优选为上述浓度范围内的3种以上不同浓度，例如配制3种、4种、5种、6种不同浓度的标 准液。
[0023] 所述铁-碳水络合物中的碳水化合物选自葡萄糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、糊精和山 梨醇中的一种或多种。
[0024] 所述铁-碳水络合物的样品与人血清混合的比例是，样品中铁的总含量以人血清 铁浓度计为 50 ?180μ g/ml，优选 65 ?170μ g/ml，例如 70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160 μ g/ml等上述范围内的任意数值。
[0025] 所述铁-碳水络合物的样品与人血清的共孵育时间为10?60min，优选30? 60min〇
[0026] 所述测量的时间点为在孵育的三个不同时间点，例如10、20或60分钟；还可以是 孵育的四个不同时间点，如10、20、30、45min。还可以是4个以上时间点。不同时间点测量 可以提高准确性，且易于监控。
[0027] 所述蛋白变性剂选自尿素、硫脲、3-[3_(胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐 (CHAPS)、二硫苏糖醇（DTT)、IPG缓冲液中的一种或多种。优选硫脲，在起到蛋白变性作用 的同时屏蔽铜离子干扰。
[0028] 所述酸性介质的加入量以使体系pH控制为1?4为宜，保证还原反应完全。酸性 介质优选为朽 1檬酸。
[0029] 所述还原剂选自抗坏血酸、还原性黄素单核苷酸、连二亚硫酸盐、羟基乙酸盐、氢 醌、乳酸或乳酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、碳酸氢盐、丙酮酸盐、琥珀酸或琥珀酸盐、果糖、半胱 氨酸和山梨醇中的一种或多种。优选为弱酸性还原剂抗坏血酸。还原剂存在的量为相对于 铁-碳水化合物络合物至少约10倍过量，优选30倍过量，更优选50倍过量。
[0030] 所述显色剂为亚铁嗪。
[0031] 在一种优选实施方式中，将酸性介质和蛋白变性剂同时加入，以及将还原剂和显 色剂同时加入，这样即不会影响检测结果，还可以简化步骤，方便操作。此外，所述显色剂与 还原剂同时加入，可以使还原产生的二价铁立即与显色剂发生反应生成有色化合物，同时 促进还原反应的进行。所述还原反应和显色反应的时间约为30?60min，优选60min。
[0032] 所述有色化合物是在用分光光度计在波长562nm处测定吸光度。
[0033] 在一种具体的实施方式中，所述测定铁-碳水化合物络合物中不稳定三价铁含量 的方法，包括步骤：
[0034] 1)标准曲线的建立：
[0035] 在室温下，配制0. 1?100 μ g/mL范围3种以上不同浓度的铁标准品系列溶液， 分别在所述铁标准品系列溶液（如100 μ 1)中加入含有柠檬酸（如200mM)的水溶液（如 700 μ 1)，再加入含抗坏血酸（如150mM)和亚铁嗪（如6mM)的水溶液（如350 μ L)，反应后 (如60min)用分光光度计于562nm处测定吸光度，以铁浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Υ， 得到标准曲线方程Y = aX+b;
[0036] 2)铁-碳水络合物样品的不稳定铁含量的测定：
[0037] 在室温下，将人血清与铁-碳水络合物样品混合进行孵育，其中样品中铁的总含 量换算为血清铁浓度为50?180 μ g/mL，分别在孵育过程中的三个或以上的不同时间点取 样品（如100 μ 1)加入含硫脲（如115mM)和柠檬酸（如200mM)的水溶液（如700 μ 1)， 然后加入含抗坏血酸（如150mM)和亚铁嗪（如6mM)的水溶液（如350 μ L)，反应后（如 60min)用分光光度计于562nm处测定吸光度，以孵育时间为横坐标X1，吸光度为纵坐标Y 1 进行线性回归，得到方程Y1 = S1XJb1，由此得到时间为0时的吸光度数值为Id1 ;将样品吸光 度数值h代入标准曲线方程，计算求出样品中不稳定铁的含量。
[0038] 同上所述，优选地，所述标准品为结晶硫酸铁铵；所述铁标准品系列溶液的浓度优 选为5?80 μ g/ml ;所述铁-碳水络合物样品与人血清混合的比例是，样品中铁的总含量 以人血清铁浓度计为65?170 μ g/ml。
[0039] 本发明中，铁-碳水络合物中不稳定三价铁的还原符合一级动力学，本发明的上 述检测方法，可以检测任意含有铁-碳水络合物的制剂，可以是口服或注射等剂型，如葡萄 糖酸铁钠注射液、蔗糖铁注射液、山梨醇铁注射液、右旋糖酐铁注射液、糊精铁注射液、复方 卡铁注射液等，检测灵敏度高、精密度好，准确度高，能够快速、准确、定量地测定铁-碳水 化合物中不稳定铁含量，可以对（尤其是静脉）铁补充制剂的质量进行科学和有效的控制， 保障临床用药的安全。
【具体实施方式】
[0040] 以下实施例可以用于进一步了解本发明的特点和优点，但不应理解为限制本发明 的保护范围。任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。
[0041] 除特别标明外，实施例所用的仪器和试剂均为普通市售产品。
[0042] 实施例1 :
[0043] 铁贮备液的配制（100 μ g/ml):精确称取结晶硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2 " 12H20] (Aladdin Industrial Corporation)0.860g，用去离子水溶解后加浓硫酸（AR) 2. 0ml，移入 IL容量瓶中加去离子水稀释至刻度作为贮备液。
[0044] 铁标准系列溶液配制：分别移取铁贮备液5,10,20,30,40ml，分别加入到IOOml 容量瓶中，加去离子水定容至刻度，摇匀作为铁标准系列溶液，浓度分别为5,10, 20, 30， 40 μ g/ml〇
[0045] 铁标准曲线建立：在室温下，于I. 5mlEP管中分别加入铁标准系列溶液各100 μ 1， 然后加入含200禮柠檬酸的水溶液（试剂1)70(^1，最后加入含15()1111抗坏血酸和61111亚 铁嗪的水溶液（试剂Π ) 350 μ L，反应60min后用分光光度计（岛津UV2401)于562nm处 测定吸光度。以浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标y进行线性回归，绘制得出标准曲线方程 为：y = 0· 0158χ+0· 0023, r = 0· 9985。
[0046] 葡萄糖酸铁钠制剂中不稳定铁含量的检测：在室温下，于I. 5mL EP管中，人血清 (Biosharp)与葡萄糖酸铁钠蔗糖复合物注射液（SANOFI AVENTIS US LLC)孵育，铁剂加入 量换算为血清铁浓度为166. 70μ g/mL，分别在孵育时间10、20、30、4511^11，取10(^1样品加 入含115mM硫脲和200mM柠檬酸的水溶液（试剂I)700ul，然后加入含150mM抗坏血酸和 6mM亚铁嗪的水溶液（试剂II) 350 μ L，反应60min后用分光光度计于562nm处测定吸光度。 [0047] 结果计算：以孵育时间为横坐标X1，吸光度为纵坐标yi进行线性回归，绘制得出曲 线方程为Y1 = 〇. 0118XJ0. 0869，r = 0. 9978。由此得到时间为0时吸光度为0. 0869,带入 铁标准曲线计算得出不稳定铁浓度为5. 354 μ g/ml。
[0048] 取同批次葡萄糖酸铁钠制剂样品共重复上述实验过程5次，进行测定和数据计 算，结果如表1所示。
[0049] 表 1
[0050] L0051」 买施例2 :
【权利要求】
1. 一种测定铁-碳水化合物络合物中不稳定三价铁含量的方法，其特征在于，所述方 法包括如下步骤： 使铁-碳水络合物与人血清接触，将与人血清结合的不稳定三价铁还原为二价铁；将 还原得到的二价铁与显色剂作用生成有色化合物，测量有色化合物的吸光度；与三价铁标 准液经过同样还原及显色反应处理获得的铁浓度-吸光度标准曲线进行比较，计算得到 铁-碳水络合物中不稳定三价铁的含量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 使铁-碳水络合物与人血清混合，在混合的三个以上不同时间点分别获取混合物，力口 入蛋白变性剂中止反应，再将与人血清结合的三价铁还原为二价铁；然后将还原得到的二 价铁与显色剂作用生成有色化合物，测得其吸光度，以混合时间为横坐标，吸光度为纵坐 标，得到曲线方程，求得时间为〇时的吸光度数值，将该吸光度数值代入由三价铁标准液经 过同样还原及显色反应处理获得的铁浓度-吸光度标准曲线方程，计算得到样品中不稳定 铁的含量。 进一步优选的，包括如下步骤： 1) 标准曲线的建立： 配制三种以上不同浓度的三价铁标准品系列溶液，在酸性介质中还原剂作用下将其还 原为二价铁，然后将显色剂与二价铁作用生成有色化合物，测得吸光度，以三价铁的浓度为 横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程； 2) 铁-碳水络合物样品的处理： 将人血清与铁-碳水络合物样品混合进行共孵育，其中所述样品中铁的总含量换算为 人血清铁浓度优选为50?180 μ g/mL，在孵育的三个以上不同时间点分别获取一定量的 样品，加入蛋白变性剂中止反应，在酸性介质中还原剂作用下将与人血清结合的铁还原为 二价铁，显色剂与二价铁作用生成有色化合物，测得吸光度，以孵育时间为横坐标，吸光度 为纵坐标，得到曲线方程，求得时间为0时的吸光度数值，将该吸光度数值代入标准曲线方 程，计算得到样品中不稳定铁的含量。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白变性剂选自尿素、硫脲、3-[3-(胆酰胺 丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐、二硫苏糖醇、IPG缓冲液中的一种或多种；优选硫脲。 所述酸性介质为柠檬酸。 所述还原剂选自还原性黄素单核苷酸、连二亚硫酸盐、羟基乙酸盐、氢醌、乳酸或乳酸 盐、柠檬酸或柠檬酸盐、碳酸氢盐、丙酮酸盐、琥珀酸或琥珀酸盐、果糖、半胱氨酸、山梨醇和 抗坏血酸中的一种或多种。优选为弱酸性还原剂抗坏血酸。 所述显色剂为亚铁嗪。
4. 如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述酸性介质和蛋白变性剂同时加入，然 后显色剂与还原剂同时加入，使还原产生的二价铁立即与显色剂发生反应生成有色化合 物；所述还原反应和显色反应的时间约为60min。 所述还原反应和显色反应的时间分别约为30?60min，优选60min。 优选地，所述酸性介质的加入量使体系pH控制为1?4。 所述还原剂用量为相对于铁-碳水化合物络合物至少约10倍过量，优选30倍过量，更 优选50倍过量。
5. 如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述有色化合物是在用分光光度计在波长 562nm处测定吸光度。
6. 权利要求1-5任一项所述的方法，包括步骤： 1) 标准曲线的建立： 在室温下，配制〇. 1?100 μ g/mL范围3种以上不同浓度的铁标准品系列溶液，分别在 所述铁标准品系列溶液（如100 μ 1)中加入含有柠檬酸（如200mM)的水溶液（如700 μ 1)， 再加入含抗坏血酸（如150mM)和亚铁嗪（如6mM)的水溶液（如350μ L)，反应后（如 60min)用分光光度计于562nm处测定吸光度，以铁浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Υ，得到 标准曲线方程Y = aX+b ; 2) 铁-碳水络合物样品的不稳定铁含量的测定： 在室温下，将人血清与铁-碳水络合物样品混合进行孵育，其中样品中铁的总含量换 算为血清铁浓度为50?180 μ g/mL，分别在孵育过程中的三个或以上的不同时间点取样品 (如100 μ 1)，加入含硫脲（如115mM)和柠檬酸（如200mM)的水溶液（如700 μ 1)，然后加 入含抗坏血酸（如150mM)和亚铁嗪（如6mM)的水溶液（如350 μ L)，反应后（如60min) 用分光光度计于562nm处测定吸光度，以孵育时间为横坐标Xi，吸光度为纵坐标Yi进行线 性回归，得到方程t = aJi+bi，由此得到时间为0时的吸光度数值为h ;将样品吸光度数值 匕代入标准曲线方程，计算求出样品中不稳定铁的含量。 同上所述，优选地，所述标准品为结晶硫酸铁铵；所述铁标准品系列溶液的浓度优选为 5?80μ g/ml ;所述铁-碳水络合物样品与人血清混合的比例是，样品中铁的总含量以人血 清铁浓度计为65?170 μ g/ml。
7. 如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述铁-碳水化合物络合物中的碳水化合 物选自葡萄糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、糊精和山梨醇中的一种或多种。 所述配制三价铁标准液的标准品可以是结晶硫酸铁铵（分子式FeNH4(S04)2 · 12H20)。 所述三价铁标准品系列溶液的浓度可以是〇. 1?100 μ g/ml，优选5?80 μ g/ml，例如 5、10、20、30、40、50、60、70、80μ g/ml以及上述范围内的其他数值。铁标准品系列标准液优 选为上述浓度范围内的3种以上不同浓度，例如配制3种、4种、5种、6种不同浓度的标准 液。 所述铁-碳水络合物的样品与人血清混合的比例是，样品中铁的总含量以人血清铁浓 度计为 50 ?180μ g/ml，优选 65 ?170μ g/ml，例如 70、80、90、100、110、120、130、140、150、 160 μ g/ml等上述范围内的任意数值。
8. 如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述铁-碳水化合物络合物样品与人血清 的共孵育时间为10?60min，优选30?60min。
9. 如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述标准品为结晶硫酸铁铵；所述铁标准 品系列溶液的浓度为5?80 μ g/ml。
10. 如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述铁-碳水络合物样品与人血清混合的 比例是，样品中铁的总含量以人血清铁浓度计为65?170 μ g/ml。
【文档编号】G01N21/31GK104237223SQ201410526312
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】赵俊, 陈祥峰, 蔡继兰, 宗在伟, 于欢, 金雪锋, 李艳芝, 刘留成 申请人:江苏奥赛康药业股份有限公司