邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，所述应用是指在用于氨基酸液相色谱一质谱联用分析的流动相中添加邻苯二甲酸，邻苯二甲酸的添加浓度为0.005?0.lmmol/L。本发明能够显著提高氨基酸的检测灵敏度，可同时改善其色谱分离效果，且应用方便，只需在流动相中加入适宜数量的邻苯二甲酸，无需改变其他分析条件，氨基酸的分析效果就会得到显著改善；另外，实验表明，长期使用添加有邻苯二甲酸的流动相，对色谱柱和质谱离子源均不会造成严重损害，且重现性好、易于定量分析，具有很好的应用推广价值。
【专利说明】邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，具体说，是涉及邻苯二甲酸作为 流动相添加剂在氨基酸液相色谱一质谱联用分析中的应用，属于氨基酸分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 氨基酸不仅是生物体内蛋白质的基本组成单元，也是体内合成神经递质、叶啉、多 胺等含氮化合物的重要前体。近期的研究表明，氨基酸还在体内起着重要的调控作用，如基 因表达过程、蛋白质的磷酸化、荷尔蒙的合成与分泌等。氨基酸在体内的存在形式主要有两 种，一种是以游离态存在于生理体液中，如血浆、尿液等之中，另一种是以结合态存在于多 肽和蛋白质中。氨基酸作为生物体内代谢循环的重要组成部分，对其定性定量分析在蛋白 质化学、生物化学、临床医学等领域的研究中都起着非常重要的作用。
[0003]目前氨基酸的分离、分析方法正在不断地拓展和完善中，这些方法包括液相色谱 与光学检测器联用技术（LC methods coupled with optical detection)、液相色谱一质谱 联用技术（简称：LC-MS)、毛细管电泳一质谱联用技术（简称：CE-MS)、气相色谱一质谱联 用技术（简称：GC_MS)、核磁方法（简称：NMR)等（参见H. Kaspar,K. Dettmer,ff. Gronwald, P. J. Oefne，Anal. Bioanal. Chem. 2009，393，445 ?452 ；C. W. Klampf 1，W. Buchberger, M. Turner, G. S. Fritz, J. Chromatogr. A. 1998，804，349 ?355.)。
[0004] 液相色谱一质谱联用方法是氨基酸的重要分析方法之一。由于液相色谱在分 离热不稳定和高沸点化合物方面的优势以及质谱超高的灵敏度和强大的鉴定能力，使得 LC-MS方法成为分离分析复杂生物样本的有效手段。使用LC-MS方法分析氨基酸还可 以进一步分为两类，一类是游离氨基酸的直接分析，主要包括离子对反相色谱一质谱方 法(Ion-pair reversed-phase LC-MS)(参见 P. Chaimbault, K. Petritis, C. Elfakir, M. Dreux, J. Chromatogr. A. 1999,855,191 ~ 202.)和亲水相互作用色谱一质谱方法（简 称：HILIC-MS)(参见 S. Guo, J. A. Duan, D. ff. Qian, Y. P. Tang,，Y. F. Qian, D. ff. ffu, S. L. Su, E. X. Shang, J. Agric. Food Chem. 2013,61, 2709 ?2719.);另一类是衍生化间接分析法， 主要是指柱前化学衍生化结合反相色谱一质谱联用方法（参见K.Guo，C. Ji，L. Li, Anal. Chem. 2007, 79,8631-8638 ；ff. -C. Yang, H. Mirzaei, X. Liu, F. E. Regnier, Anal. Chem. 2006, 78,4702 ?4708.)。
[0005] 游离氨基酸的直接分析操作简单，所需分析时间短，前处理时引入的误差因素较 少，在分析大量、复杂的生物样本时具有较为明显的优势。
[0006] 亲水相互作用色谱（简称：HILIC)是近年来色谱领域研究的热点之一。它是一种 用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固 定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动 相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱的灵敏度。采用亲水相互作用色谱一质谱联用技 术分离氨基酸时，无需对样品进行衍生化，样品经处理后直接进样，结合超高效液相色谱可 以在二十分钟内实现多种氨基酸的分离。由于氨基酸为两性化合物，为了有利于其分离和 改善峰形，通常需要在流动相中添加较高浓度的甲酸与甲酸铵或醋酸与醋酸铵形成的缓冲 溶液，而流动相中较高浓度的缓冲盐会抑制待测物的响应，影响了检测灵敏度。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供邻苯二甲酸作为流动相添 加剂在氨基酸液相色谱一质谱联用分析中的应用，以提高氨基酸的检测灵敏度和色谱分离 效果。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 本发明所述的邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，是指在用于氨基酸液相色谱一 质谱联用分析的流动相中添加邻苯二甲酸，邻苯二甲酸的添加浓度为0. 005?0. lmmol/L, 优选为 0. 08mmol/Lo
[0010] 作为优选方案，所述的流动相由水相和有机相组成，且水相和有机相中均含有甲 酸与甲酸铵。
[0011] 作为进一步优选方案，所述的水相中含有5?10mmol/L的甲酸铵和0. IV %? 0. 3V%的甲酸，所述的有机相中含有1?5mmol/L的甲酸铵和0. 1V%?0. 3乂％的甲酸。
[0012] 作为更进一步优选方案，所述的水相由0.005?0. lmmol/L邻苯二甲酸、5? 10mmol/L甲酸铵、0. 1V%?0. 3V%甲酸及水形成；所述的有机相由0. 005?0. lmmol/L邻 苯二甲酸、1?5mmol/L甲酸铵、0. 1V*%?0. 3V%甲酸、0. 1V%甲醇及乙腈形成。
[0013] 作为最佳方案，所述的水相由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、10mmol/L甲酸铵、0. 2V*% 甲酸及水形成；所述的有机相由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、2mmol/L甲酸铵、0. 2V%甲酸、 0. 1V%甲醇及乙腈形成。
[0014] 作为优选方案，所述的氨基酸液相色谱一质谱联用分析，包括如下步骤：
[0015] a)配制一系列由标准溶液和内标溶液形成的工作溶液；
[0016] b)采用本发明所述的添加有邻苯二甲酸的流动相，对步骤a)配制的一系列工作 溶液进行液相色谱串联质谱分析，绘制内标法标准曲线；
[0017] c)采用与步骤b)相同的流动相，对待测的游离氨基酸样品进行液相色谱串联质 谱分析；
[0018] d)根据已建立的内标法标准曲线计算样品中的氨基酸浓度。
[0019] 作为进一步优选方案，所述液相色谱的分离方式为亲水相互作用色谱（HILIC)，所 述质谱的检测方式为多反应监测（MRM)。
[0020] 作为进一步优选方案，所述标准溶液的配制方法如下：准确称取苯丙氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏 氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、Y -氨基丁酸、赖氨酸、天门冬氨酸和瓜 氨酸、羟基脯氨酸、2-氨基丁酸、￠-丙氨酸各10mg及酪氨酸5mg中的至少一种标准品，用 100mL由乙腈与水按体积比为1:1形成的混合溶剂超声溶解后，再加入混合溶剂稀释至刻 度，再根据需要稀释成不同浓度的标准溶液。
[0021] 作为进一步优选方案，所述内标溶液的配制方法如下：准确配制含有四种同位 素氨基酸内标物的内标储备液，其中：d5-苯丙氨酸和d3-丙氨酸的浓度均为10iig/mL， d3-丝氨酸和d5-谷氨酸的浓度均为100 ii g/mL，使用时稀释成所需浓度的内标溶液。
[0022] 作为进一步优选方案，从生物组织样本制备游离氨基酸样品的方法如下：称取生 物组织样本每10mg加入100 y L去离子水，充分匀浆；取匀浆液20ii L，加入内标溶液20ii L 和160UL甲醇；涡旋充分后，离心；取上层清液40 yL至新的样品管中，氮气吹干；使用 200 y L由乙腈与水按体积比为1:1形成的混合溶剂重新溶解。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
[0024] 1)本发明提供的添加有邻苯二甲酸的流动相，能够显著提高氨基酸的检测灵敏 度，同时改善其色谱分离效果，与未添加邻苯二甲酸的流动相相比，氨基酸的检测限可以降 低4?50倍；
[0025] 2)本发明所提供的添加有邻苯二甲酸的流动相，简单易得、配制和使用方便，只需 在流动相中加入适宜数量的邻苯二甲酸，无需改变其他分析条件，诸如：样品制备方法、色 谱分离条件、质谱检测参数等，氨基酸的分析效果就会得到显著改善；
[0026] 3)实验表明，长期使用添加有邻苯二甲酸的流动相，对色谱柱和质谱离子源均不 会造成严重损害，且重现性好、易于定量分析；
[0027] 4)实验证明，应用本发明方法检测分析人体甲状腺癌组织和癌旁正常组织中氨基 酸的含量能够获得很好的效果，说明本发明具有很好的应用推广价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1是分别使用本发明流动相（添加有邻苯二甲酸）和对比流动相（未添加邻苯 二甲酸）检测氨基酸混合标准溶液时获得的MRM谱图；其中的a图为使用本发明流动相，b 图为使用对比流动相；
[0029] 图2是分别使用本发明流动相（添加有邻苯二甲酸）和对比流动相（未添加邻苯 二甲酸）检测苯丙氨酸时获得的MRM谱图；其中的a图为使用本发明流动相，b图为使用对 比流动相；
[0030] 图3是分别使用本发明流动相（添加有邻苯二甲酸）和对比流动相（未添加邻苯 二甲酸）检测脯氨酸时获得的MRM谱图；其中的a图为使用本发明流动相，b图为使用对比 流动相。
【具体实施方式】
[0031 ] 下面结合实施例对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。
[0032] 实施例中所用的质谱仪为Shimadzu公司的LCMS-8040质谱仪。
[0033] 实施例1
[0034] 本实施例的目的是考察邻苯二甲酸在流动相中的有无与氨基酸信号响应之间的 关系，以验证邻苯二甲酸作为流动相添加剂运用于氨基酸分析的可行性。
[0035] 1、准确称取苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷 氨酰胺、半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、 Y -氨基丁酸、赖氨酸、天门冬氨酸和瓜氨酸、羟基脯氨酸、2-氨基丁酸、P -丙氨酸各10mg 及酪氨酸5mg，置于lOOmL容量瓶中，加入乙腈/水（v/v，1:1)超声溶解后，再加入混合溶剂 稀释至刻度，制成待测标准品混合液；
[0036] 2、使用本发明所述的流动相：A相（即水相）由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、lOmmol/ L甲酸铵、0. 酸及水形成；B相（即有机相）由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、2mmol/L甲 酸铵、0. 2V%甲酸、0. 1￥%甲醇及乙腈形成；及对比流动相：A相（即水相)由10mmol/L甲 酸铵、0. 2V%甲酸及水形成；B相（即有机相)由2mmol/L甲酸铵、0. 2V%甲酸及乙腈形成； 及采用梯度洗脱程序为：0min:B 85%,6min:B 80%U0min:B 70%U2-14min:B 60%，然 后B相重新回到85%平衡8min再进行下一次进样；流动相的总流速为0. 4mL/min ;柱温为 40°C;进样量为L ;对上述标准品混合液分别进行液相色谱串联质谱分析，得到图1所示 的MRM谱图，其中的a图为使用本发明流动相，b图为使用对比流动相；由图1可见：流动相 中邻苯二甲酸的存在对氨基酸信号强度的影响很大，当流动相中含有邻苯二甲酸时，所有 氨基酸的质谱信号强度均有明显的提升，平均提升在10倍左右。
[0037] 准确称取苯丙氨酸和脯氨酸各10mg，分别置于100mL容量瓶中，加入乙腈/水（v/ v, 1：1)超声溶解后，再加入混合溶剂稀释至刻度，制成待测苯丙氨酸标准品溶液和待测脯 氨酸标准品溶液；分别按上述流动相（添加有邻苯二甲酸）和对比流动相（未添加邻苯二 甲酸）及分析条件进行液相色谱串联质谱分析，得到图2所示的MRM谱图和图3所示的MRM 谱图，其中的a图均为使用本发明流动相，b图均为使用对比流动相；由图2和图3可见：在 流动相中含有邻苯二甲酸时，氨基酸的半峰宽减小，柱效明显升高，分离得到明显改善，进 一步说明采用本发明技术，能够显著提高氨基酸的检测灵敏度，同时可明显改善其色谱分 离效果。
[0038] 实施例2
[0039] 本实施例的目的是使用添加有邻苯二甲酸的流动相，建立内标法测定氨基酸的标 准曲线，考察该方法定量的可行性。
[0040] a)准确称取苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷 氨酰胺、半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、 Y -氨基丁酸、赖氨酸、天门冬氨酸和瓜氨酸、羟基脯氨酸、2-氨基丁酸、P -丙氨酸各10mg 以及酪氨酸5mg，置于100mL容量瓶中，用100mL由乙腈与水按体积比为1:1形成的混合溶 剂超声溶解后，再加入混合溶剂稀释至刻度，再根据需要稀释成不同浓度的标准溶液；
[0041] b)准确配制含有四种同位素氨基酸内标物的内标储备液，其中：d5-苯丙氨酸和 d3-丙氨酸的浓度均为10 u g/mL, d3-丝氨酸和d5-谷氨酸的浓度均为100 u g/mL,使用时 稀释成所需浓度的内标溶液；
[0042] c)将得到的不同浓度的标准溶液与特定浓度的内标溶液等体积混合作为系列工 作溶液，工作溶液中d5-苯丙氨酸和d3-丙氨酸的浓度为0. 1 u g/mL, d3_丝氨酸和d5_谷 氨酸的浓度为1 U g/mL ；
[0043] d)使用流动相：A相(即水相)由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、10mmol/L甲酸铵、 0. 2V%甲酸及水形成出相（即有机相）由0. 08mmol/L邻苯二甲酸、2mmol/L甲酸铵、0. 2V% 甲酸、0. IV %甲醇及乙腈形成；及采用梯度洗脱程序为：0min:B 85 %>6min:B 80 %> 10min:B 70%> 12-14min:B 60%,然后B相重新回到85%平衡8min再进行下一次进样；流 动相的总流速为0. 4mL/min ;柱温为40°C;进样量为2 u L ;对上述系列工作溶液由低浓度至 高浓度依次进样进行液相色谱串联质谱分析（每种浓度分别进样三次）；
[0044] e)绘制内标法标准曲线，求出回归方程：y = ax+b，其中：y为多反应监测信号比 率=氨基酸峰面积/内标氨基酸峰面积，x为氨基酸的质量体积比浓度（ii g/mL)种内标 氨基酸可以对应多种待分析氨基酸。
[0045] 表1为得到的标准曲线、相关系数、线性范围等分析结果。
[0046] 表1标准曲线、相关系数、线性范围
[0047]
【权利要求】
1.邻苯二甲酸在氨基酸分析中的应用，其特征在于：在用于氨基酸液相色谱一质谱联 用分析的流动相中添加邻苯二甲酸，邻苯二甲酸的添加浓度为0. 005?0. lmmol/L。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的流动相由水相和有机相组成，且水相 和有机相中均含有甲酸与甲酸铵。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的水相中含有5?lOmmol/L的甲酸铵 和0. 1V%?0. 3V%的甲酸，所述的有机相中含有1?5mmol/L的甲酸铵和0. 1V%?0. 3V% 的甲酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的水相由0.005?0. lmmol/L邻苯 二甲酸、5?10mmol/L甲酸铵、0. 1V%?0. 3V%甲酸及水形成；所述的有机相由0. 005? 0. lmmol/L邻苯二甲酸、1?5mmol/L甲酸按、0. 1V*%?0. 3V%甲酸、0. 1V%甲醇及乙臆形 成。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氨基酸液相色谱一质谱联用分析，包 括如下步骤： a)配制一系列由标准溶液和内标溶液形成的工作溶液； b)采用本发明所述的添加有邻苯二甲酸的流动相，对步骤a)配制的一系列工作溶液 进行液相色谱串联质谱分析，绘制内标法标准曲线； c)采用与步骤b)相同的流动相，对待测的游离氨基酸样品进行液相色谱串联质谱分 析； d)根据已建立的内标法标准曲线计算样品中的氨基酸浓度。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述液相色谱的分离方式为亲水相互作用 色谱（HILIC)，所述质谱的检测方式为多反应监测（MRM)。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述标准溶液的配制方法如下：准确称取 苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丙氨 酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、氨基丁酸、赖氨酸、天 门冬氨酸和瓜氨酸、羟基脯氨酸、2-氨基丁酸、P -丙氨酸各10mg及酪氨酸5mg中的至少一 种标准品，用100mL由乙腈与水按体积比为1:1形成的混合溶剂超声溶解后，再加入混合溶 剂稀释至刻度，再根据需要稀释成不同浓度的标准溶液。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述内标溶液的配制方法如下：准确配制 含有四种同位素氨基酸内标物的内标储备液，其中：d5-苯丙氨酸和d3-丙氨酸的浓度均为 10 u g/mL, d3-丝氨酸和d5-谷氨酸的浓度均为100 u g/mL,使用时稀释成所需浓度的内标 溶液。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，从生物组织样本制备游离氨基酸样品的方 法如下：称取生物组织样本每10mg加入100 u L去离子水，充分匀浆；取匀浆液20 u L，加入 内标溶液20 y L和160 y L甲醇；涡旋充分后，离心；取上层清液40 y L至新的样品管中，氮 气吹干；使用200 y L由乙腈与水按体积比为1:1形成的混合溶剂重新溶解。
【文档编号】G01N30/02GK104215721SQ201410527881
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】郭寅龙, 祁婉舒, 张立, 张菁, 吴梦茜, 范若静 申请人:中国科学院上海有机化学研究所