一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法
【专利摘要】一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，属于分析化学、食品安全检测【技术领域】。本发明将氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶构建了双酶偶联体系；氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340nm处吸光值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测。该方法能够快速检测溶液及模拟黄酒体系中的氨基甲酸乙酯，检测限低至0.1μmol·L-1，为发酵食品和饮料中氨基甲酸乙酯的检测提供了有效的手段。
【专利说明】一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，属于分析化学、食 品安全检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，简称EC)，是一种具有遗传毒性及致癌性的物 质，对啮齿类动物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。EC广泛存在于发酵食品(如 酱油、腐乳等)、酿造酒(如黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒等)和蒸馏酒(如白兰地、威士忌等)中， 主要通过酒精类饮料的摄入进入人体内。研究表明氨基甲酸乙酯在生物体内约有0. 5%被 细胞色素 P450氧化为乙酰基氨基甲酸乙酯，再进一步形成乙酰基氨基甲酸乙酯环氧化物， 此种物质能够在生物体内形成DNA加聚物，导致DNA结构的双链被破坏，进而导致细胞癌 变；另有〇. 1%左右的氨基甲酸乙酯被细胞色素 P450氧化为N-羟基氨基甲酸乙酯，这种物 质诱导Cu2+调控的DNA损伤，引起癌变。
[0003] 早在1985年，加拿大卫生与预防部门对酒精类饮料中的氨基甲酸乙酯含量做了 强制性限量标准，随后世界其他国家也先后制定了各种饮料酒中的限量标准。同时，采取减 少和去除食品中EC前体物质、选用选择性强和特性良好的能降低发酵过程中尿素排泄量 的菌株、对发酵过程和蒸馏过程进行工艺改良、对发酵酒进行脲酶和EC降解酶酶法后处理 等方法降低成品中EC的含量。各种检测饮料酒以及其他发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的 方法也不断发明和改善。
[0004] 现阶段检测氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄层分析法、傅立叶变换近红外 光谱法（FTIR)，近红外光谱技术（NIR)，气相色谱分析法（GC)，气相色谱-质谱联用法 (GC-MS)，气相色谱-串联质谱法（GC/MS/MS)，气相二维或多维色谱-稳定同位素稀释质谱 联用技术（GC/GC/CIMS)，气相色谱/热离子检测器法（GC/TSD)，高效液相色谱（HPLC)以及 高效液相-荧光法（HPLC-FLD)，液相色谱-串联质谱法（HPLC/MS/MS)等。以上检测方法 虽然能够在一定范围内对氨基甲酸乙酯含量进行检测和定量，但大多需要对样品进行预处 理、操作繁琐费时、重现性差、操作系统误差较大、方法的准确度和精确度较差、特异性低、 容易受到发酵基体中其他物质的干扰，特别是气相色谱以及各种萃取方法需要有毒有机溶 剂不利于分析人员的身体健康，在萃取过程及溶剂回收过程中会伴随着严重的污染问题； 往往需要精密昂贵的检测仪器如质谱、电子捕获检测器、原子发射光谱检测器等，并且维护 成本高，只能在具有大型、贵重仪器的专业实验室内进行检测，难以推广使用，不能满足我 国发酵食品及酒精饮料中氨基甲酸乙酯快捷、简便、经济、环保的检测要求和限制标准。因 此，研发和建立方便实用的快速检测方法是对发酵食品和饮料中EC含量检测所迫切需要 解决的问题。
[0005] 随着生物传感器的发展，双酶和多酶联用的生物传感器逐渐引起人们关注并得到 了广泛的应用。现阶段已有许多酶传感器用于水体中氨、尿素、重金属离子、过氧化氢、苯 酚、有机磷杀虫剂、坏血酸、谷氨酸以及其他氨基酸的检测。但目前还没有报道用于检测EC 含量的酶传感器。
[0006] 在2012年，本课题组的专利ZL201210125030. 6《一种黄酒用氨基甲酸乙酯降解 酶产生菌》，已公开了一种黄酒用氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌，其分类命名为变幻青霉 rariaAi/e) JN-A525,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，其保藏编号为：CGMCC No. 5763。
[0007] 本发明在前期筛选出产氨基甲酸乙酯降解酶的菌株的基础上，构建了氨基甲酸乙 酯降解酶和谷氨酸脱氢酶双酶体系实现对EC的快速检测。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种用于快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的分光光度方 法，要解决的技术问题是构建检测氨基甲酸乙酯所需要的双酶偶联体系。该体系中氨基甲 酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物 α -酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH被氧 化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340 nm处吸光 值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测，原理图如图1所示。
[0009] 本发明的技术方案，一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步骤为： (1) 构建双酶偶联催化体系 a、 酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC N0. 5763 细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商 品酶； b、 酶液以及其他溶液的制备：用
【权利要求】
1. 一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，其特征在于步骤为： (1) 构建双酶偶联催化体系 a、 酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC No. 5763 细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商 品酶； b、 酶液以及其他溶液的制备：用25mmol吨4 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及 谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U · ml/1及10U · ml/1 ;配制540mmol · Γ1 α -酮戊二 酸溶液；7. 5mmol · PNADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液； c、 双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20 μ L上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷 氨酸脱氢酶溶解液，66 μ L的α -酮戊二酸溶液，20 μ L NADH溶液，20 μ L lmmol · L-1氨基 甲酸乙酯溶液和454 μ L PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600 μ L,置于石英比色皿中混 合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸 光值的变化情况； (2) 双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定： d、 用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0. 001、0. 005、0. 01、0. 05、0. 1、0. 5和 1 mmol · L 1的母液； e、 向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基 甲酸乙酯浓度分别为0、0· 1、0· 2、0· 5、1、2、5、10、20、30、40、50 μπιο?吨―1 ;将所得的溶液体 系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应 时间为5min ;将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线； f、 向黄酒样品中添加氨基甲酸乙酯母液使得样品中EC含量为5、10、20μπι〇1 · Γ1，在 双酶偶联反应体系中反应5min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线 计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。
【文档编号】G01N21/31GK104266984SQ201410533042
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】周楠迪, 卢晓霞, 田亚平 申请人:江南大学