人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用。本发明公开检测人热休克蛋白gp96含量的物质在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断疾病的预后的产品中的应用。本发明证明人热休克蛋白可以作为一种新的肝硬化、肝癌标志物。本发明公开的试剂盒对于肝硬化、肝癌的早期筛查、预防、治疗和治疗后监测具有重大意义。
【专利说明】人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用，属于生物医学 领域。
【背景技术】
[0002] 热休克蛋白gp96,即GRP94 (glucose-regulatedprotein94)，是存在于真核生物 细胞内质网中分子量约为96kDa的热休克蛋白。它属于HSP90家族，是胞质HSP90的旁系 同源蛋白，约占细胞总蛋白的1%。在正常的生理条件下，gp96定位于细胞内质网中，也存 在细胞的质膜上。gp96N端的21个疏水性氨基酸的信号肽介导gp96分子进入内质网，在内 质网中在蛋白酶的作用下将信号肽被切除，gp96分子通过C端的KDEL序列与内质网膜上 的KDEL受体相互作用使gp96分子滞留于内质网中，在内质网中被加工。gp96在进化过程 中是高度保守，成熟的gp96蛋白由四个结构域组成：N端结构域，含有ATP结合区及结合抗 原肽的区域；带电铰链区，是gp96发挥活性必需的，具有调节gp96构象的改变，带电铰链区 又可以分为E/D-密集序列和多聚赖氨酸重复序列，E/D-密集序列含有1-2个钙离子结合 位点；中间结构域，含有参与蛋白-蛋白互作用的亮氨酸拉链区和KEKE区；C端结构域，含 有二聚体区，还有与内质网上受体结合的KEDL序列。
[0003] 肝硬化是临床常见的慢性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性 肝损害。在我国大多数由肝炎转变肝硬化，少部分为酒精和血吸虫导致肝硬化。早期肝硬 化肝脏代偿功能较强可无明显症状，后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多 系统受累，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发 症而死亡。因此，迫切需要找到新的标志物作为早期肝硬化的检测指标。
[0004]原发性肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC，简称肝癌），在全世界范围内 发病率排在第六位，每年全世界的发病人数是62. 6万，我国每年死于肝癌约11万人，占全 世界肝癌死亡人数的45%。相对于高死亡率，早期肝癌的发现比例却非常低。近年来，虽然 针对肝癌的治疗手段不断更新（包括手术切除、肝移植术、放射治疗、介入治疗、微创消融 治疗等），但肝癌治疗的总体疗效并无明显提高，复发和转移仍然是影响肝癌预后的最主要 因素。目前肝硬化、肝癌的检测主要通过影像学、组织活检等，血清学检测的灵敏度和特异 性不高，多数患者一旦确诊即为肝硬化或肝癌的晚期，失去了最佳的治疗时期。因此，急需 挖掘对肝硬化、肝癌早期筛查的分子标志物和简便易行的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供人热休克蛋白gp96在制备筛查肝病的产品中的应用。
[0006] 本发明提供检测人热休克蛋白gp96含量的物质在制备筛查或辅助诊断疾病的产 品或辅助判断疾病的预后的产品中的应用；
[0007] 所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0008]上述应用中，所述检测人热休克蛋白gp96含量的物质包含人热休克蛋白gp96和 /或人热休克蛋白gp96的抗体；
[0009] 所述人热休克蛋白gp96的抗体具体为人热休克蛋白gp96的单克隆抗体、人热休 克蛋白gp96的多克隆抗体或人热休克蛋白gp96的基因工程抗体。
[0010] 上述任一所述的应用中，所述检测人热休克蛋白gp96含量的物质还包含通过酶 联免疫吸附法测定人热休克蛋白gp96含量所需的试剂中除人热休克蛋白gp96和人热休克 蛋白gp96的抗体之外的试剂和所需的仪器。
[0011] 上述任一所述的应用中，所述酶联免疫吸附测定法为ELISA双抗体夹心法；
[0012] 所述ELISA双抗体夹心法中人热休克蛋白gp96的抗体具体为人热休克蛋白gp96 的单链抗体和/或人热休克蛋白gp96的多克隆抗体和/或标记的抗所述人热休克蛋白 gp96的多克隆抗体的二抗；
[0013] 所述标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗具体为酶标记的抗所 述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗；
[0014] 所述酶标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗的酶可以催化底物 显色；
[0015] 所述人热休克蛋白gp96的单链抗体具体为gp96-scFv_comp抗体，该抗体的序列 如SEQIDNo.1所示，该抗体能特异性结合人热休克蛋白gp96的N端；
[0016] 所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体具体的商品名称为山羊多克隆抗体，该抗 体购自SantaCruzBiotech，产品目录号为SC-1794,该抗体特异性结合于人热休克蛋白 gp96的C端；
[0017] 所述酶标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗具体的商品名称为 兔抗山羊二抗-HRP，该二抗购自SantaCruzBiotech，产品目录号为SC-2922。
[0018] 含有人热休克蛋白gp96编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌作 为制备人热休克蛋白gp96所需的生物材料在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断 疾病的预后的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0019] 所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0020] 上述应用中，所述人热休克蛋白gp96的编码基因为如下1)-3)任一所示：
[0021] 1)SEQIDNo. 3 所示的DNA分子；
[0022] 2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码人热休克蛋白gp96的DNA分 子；
[0023] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码人热休克蛋白gp96 的DNA分子。
[0024] 含有人热休克蛋白gp96的抗体的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或 重组菌或人热休克蛋白gp96的抗体的免疫原或抗原作为制备人热休克蛋白gp96的抗体所 需的生物材料在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断疾病的预后的产品中的应用 也属于本发明的保护范围；
[0025] 所述人热休克蛋白gp96的抗体为人热休克蛋白gp96的单克隆抗体或人热休克蛋 白gp96的多克隆抗体或人热休克蛋白gp96的基因工程抗体；
[0026] 所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0027] 上述任一所述的应用中，所述疾病为肝硬化或肝癌。
[0028] -种筛查或辅助诊断疾病或辅助判断疾病的预后的试剂盒也属于本发明的保护 范围，该试剂盒包含检测人热休克蛋白gp96含量的物质；
[0029] 所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0030] 上述试剂盒中，所述检测人热休克蛋白gp96含量的物质包含人热休克蛋白gp96 和/或人热休克蛋白gp96的抗体；
[0031] 所述人热休克蛋白gp96的抗体为人热休克蛋白gp96的单克隆抗体或人热休克蛋 白gp96的多克隆抗体或人热休克蛋白gp96的基因工程抗体。
[0032] 上述任一所述的试剂盒中，所述疾病为肝硬化或肝癌；
[0033] 所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载如以下1)和/或2)和/或3)所示 的内容：
[0034] 1)以待测患者的血清为检测对象，如果待检血清中人热休克蛋白gp96含量 < 70ng/mL，该待测患者候选为非肝硬化患者或非肝癌患者；如果待检血清中人热休克蛋 白gp96含量彡220ng/mL并且<800ng/mL,该待测患者候选为肝硬化患者；如果待检血清中 人热休克蛋白gp96含量彡500ng/mL,该待测患者候选为肝癌患者；
[0035] 2)以肝硬化患者的血清为检测对象，待检血清中人热休克蛋白gp96含量<500ng/ mL的肝硬化患者预判断为5年内肝癌发病率低于待检血清中人热休克蛋白gp96含量 彡500ng/mL的肝硬化患者5年内肝癌发病率的肝硬化患者；
[0036] 或，
[0037] 血清中人热休克蛋白gp96含量<500ng/mL的肝硬化患者的5年内肝癌发病率低， 血清中人热休克蛋白gp96含量彡500ng/mL的肝硬化患者的5年内肝癌发病率高；
[0038] 所述低是指肝癌发病率彡4. 3 % ;
[0039] 所述高是指肝癌发病率彡12. 7% ;
[0040] 3)以肝癌患者的血清为检测对象，待检血清中人热休克蛋白gp96含量<800ng/mL 的肝癌患者预判断为总生存期长于待检血清中人热休克蛋白gp96含量> 800ng/mL的肝癌 患者的总生存期的肝癌患者；
[0041] 或，
[0042] 血清中人热休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝癌患者的总生存期为2. 8±0. 7 年，血清中人热休克蛋白gp96含量彡800ng/mL的肝癌患者的总生存期为1. 2±0. 4年； [0043] 所述总生存期为从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。
[0044] 上述任一所述的试剂盒中，所述酶联免疫吸附测定法为ELISA双抗体夹心法；
[0045] 所述ELISA双抗体夹心法中人热休克蛋白gp96的抗体具体为人热休克蛋白gp96 的单链抗体和/或人热休克蛋白gp96的多克隆抗体和/或标记的抗所述人热休克蛋白 gp96的多克隆抗体的二抗；
[0046] 所述标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗具体为酶标记的抗所 述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗；
[0047] 所述酶标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗的酶可以催化底物 显色；
[0048] 所述人热休克蛋白gp96的单链抗体具体为gp96-scFv_comp抗体，该抗体的序列 如SEQIDNo. 1所示，该抗体能特异性结合人热休克蛋白gp96的N端；
[0049] 所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体具体的商品名称为山羊多克隆抗体，该抗 体购自SantaCruzBiotech，产品目录号为SC-1794,该抗体特异性结合于人热休克蛋白 gp96的C端；
[0050] 所述酶标记的抗所述人热休克蛋白gp96的多克隆抗体的二抗具体的商品名称为 兔抗山羊二抗-HRP，该二抗购自SantaCruzBiotech，产品目录号为SC-2922。
[0051] 本发明证明人热休克蛋白gp96可以作为一种新的肝硬化、肝癌标志物。本发明提 供的试剂盒对于肝硬化、肝癌的早期筛查、预防、治疗和治疗后监测具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1为人热休克蛋白gp96含量检测标准曲线。
[0053] 图2为健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人热休克蛋白gp96水平的检测与统计 分析结果。
【具体实施方式】
[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056] 下述实施例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。
[0057] 包被液（简称CB)按照如下方法制备：将1. 59gNa2C03、2. 93NaHC03、0. 2gNaN3溶 于适量蒸馏水，加蒸馏水定容至1L，再调溶液的pH至9. 6,最后将溶液用0. 22yM的滤膜过 滤。
[0058]PBS缓冲液按照如下方法制备：将 8gNaCl、0. 2gKC1、3. 625gNa2HP04 ? 12H20、 0. 24gKH2P04溶于适量蒸馏水，加蒸馏水定容至1L，再调溶液的pH至7. 3。
[0059]PBST缓冲液按照如下方法制备：将 8gNaCl、0. 2gKC1、3. 625gNa2HP04 ? 12H20、 0. 24gKH2P04溶于适量蒸馏水，加5mL的吐温-20,再加蒸馏水定容至1L，再调溶液的pH至 7. 3。
[0060] 封闭液按照如下方法制备：将5g牛血清白蛋白（BSA)用PBS缓冲液溶解，再用PBS 缓冲液定容至l〇〇mL。
[0061] 终止液按照如下方法制备：将21. 7ml浓硫酸（98%)加入到蒸馏水中，并用蒸馏 水定容至200mL。
[0062] gp96-scFv_comp抗体按照文献"桂明明，武慧英，孙I路，等.毕赤酵母表达 gp96-SCFv抗体及生物活性测定[J].生物工程学报，2014, 30 (4) : 595?604. "公开的方法 进行制备，该抗体特异性结合于人热休克蛋白gp96的N端。
[0063] 山羊多克隆抗体购自SantaCruzBiotech,产品目录号为SC-1794,该抗体特异性 结合于人热休克蛋白gp96的C端。
[0064] 兔抗山羊二抗-HRP购自SantaCruzBiotech，产品目录号为SC-2922。
[0065]TMB购自eBioscience，产品目录号为 00-4201-56。
[0066] 下述实施例中的健康人血液、肝硬化患者血液、肝癌患者血液或未知血液样本由 中国医学科学院肿瘤医院和北京佑安医院提供，所有血样采集均经过血液提供者的知情同 意，并且均签署知情同意书。
[0067]实施例1、采用酶联免疫吸附法（ELISA)建立人热休克蛋白gp96含量检测标准曲 线
[0068] 人热休克蛋白gp96标准曲线的建立是采用ELISA双抗体夹心法，具体如下：[0069]一、包被：用包被液稀释gp96-scFv_comp抗体（其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所 示）至其浓度为1Ug/mL,包被于96孔板中，每孔100iiL,于4°C包被过夜。
[0070] 二、洗涤：用PBST缓冲液洗涤3次，每次lmin。
[0071] 三、封闭：每孔加入200iiL封闭液，置于37°C封闭2h。
[0072] 四、洗涤：用PBST缓冲液洗涤3次，每次lmin。
[0073] 五、加样：将人热休克蛋白gp96(其氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，编码基因序 列如SEQIDNo. 3所示）用封闭液稀释，配制成20000ng/mL的浓度，并用封闭液进行2倍 倍比稀释，最终浓度为31. 25ng/mL，得到系列梯度稀释的gp96蛋白溶液，将具有不同浓度 的系列梯度稀释的gp96蛋白溶液加入96孔板，每孔100iiL，每1个浓度重复3个孔，为实 验孔。同时设置空白孔（不加gp96蛋白溶液只加100iiL封闭液），于37°C孵育2h。
[0074] 六、洗涤：用PBST缓冲液洗涤5次，每次lmin。
[0075] 七、加检测抗体：用封闭液稀释检测抗体（山羊多克隆抗体）（封闭液与检测抗体 的体积比为1000:1)得到检测抗体溶液，每孔加入100UL，置于37°C孵育lh。
[0076] 八、洗涤：用PBST洗涤5次，每次lmin。
[0077] 九、加酶标抗体：用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊二抗（兔抗山羊 二抗-HRP)(封闭液与兔抗山羊二抗-HRP的体积比为1000:1)得到二抗溶液，每孔加入lOOuL，置于 37°C孵育lh。
[0078] 十、洗涤：用PBST洗涤7次，每次lmin。
[0079] i^一、加底物液显色：每孔加入100ULTMB底物液，37°C避光反应10min。
[0080] 十二、终止反应：每孔加入50iiL终止液，室温反应5min。
[0081] 十三、读数：将96孔板置于酶标检测仪上，于450nm处读取各孔的吸光值。
[0082] 十四、数据分析：计算每一浓度的3个重复孔的吸光值的平均值，再分别减去空白 孔的吸光值，得到实验孔的0D450。
[0083] 十五、绘制标准曲线：以实验孔的0D450为横坐标，人热休克蛋白gp96的质量为纵 坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线公式。
[0084] 人热休克蛋白gp96含量检测标准曲线如图1所示。
[0085] 图1表明，当人热休克蛋白gp96溶液的浓度在0?20000ng/mL范围内，0D450与 人热休克蛋白gp96质量的线性关系良好，相关系数为0.9991。空白孔0D450在0.05以下， 本方法可以特异的检测到浓度为Ing/mL的人热休克蛋白gp96,灵敏度高。
[0086] 实施例2、健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人热休克蛋白gp96水平的检测与 统计分析
[0087] 一、健康人群、肝硬化和肝癌患者血清分离
[0088] (1)按照临床采血方法抽取患者的血液5mL于离心管中，4°C静置3h。
[0089](2)将离心管于 4°C，2000rpm?3000rpm离心 10min。
[0090] (3)移液器吸取上层淡黄色的血清，将收集的血清于-20°c保存。
[0091] 共临床收集健康人血清样本20例，肝硬化患者血清样本30例，肝癌患者血清样本 30例。
[0092] 二、采用实施例1的ELISA双抗体夹心法检测健康人群、肝硬化和肝癌患者血清样 本中人热休克蛋白gp96蛋白含量。其中仅将步骤五中的人热休克蛋白gp96溶液替换为步 骤一制备的待检血清样本，得到样本的0D450值，将该值带入实施例1得到的标准曲线公 式，计算得到样本的人热休克蛋白gp96的质量，并换算得到样本的人热休克蛋白gp96的含 量。
[0093] 健康人群、肝硬化和肝癌患者血清中人热休克蛋白gp96水平的检测与统计分析 结果如图2所示。图2中，正常代表健康人群的血清；肝硬化代表肝硬化患者的血清；肝癌 代表肝癌患者的血清。
[0094] 图2表明，分别与健康人群相比，肝硬化患者、肝癌患者血清中人热休克蛋白gp96 含量显著升高且具有极显著性差异（p〈0.01)。
[0095] 通过对大量健康人血清，肝硬化患者血清，肝癌患者血清样本进行上述人热休克 蛋白gp96水平的检测与统计分析，建立如下评判标准：
[0096] 检测对象的血清中人热休克蛋白gp96含量< 70ng/mL，该检测对象候选为非肝硬 化患者或非肝癌患者。
[0097] 检测对象的血清中人热休克蛋白gp96含量彡220ng/mL并<800ng/mL，该检测对象 候选为肝硬化患者。
[0098] 检测对象的血清中人热休克蛋白gp96含量> 500ng/mL，该检测对象候选为肝癌 患者。
[0099] 实施例3、评判标准的准确性分析
[0100] 一、对未知血液样本进行实施例2的检测，根据实施例2的评判标准统计得到健康 人的检测样本数，肝硬化患者的检测样本数，肝癌患者的检测样本数。
[0101] 二、根据肿瘤标记物的检测、超声显像、电子计算机断层扫描CT、磁共振成像、放射 性、肝组织活检或细胞学检查等综合指标对未知血液样本进行检测，得到健康人的实际样 本数，肝硬化患者的实际样本数，肝癌患者的实际样本数。
[0102] 三、对检测结果按金标准确定的二项分类总体，如病例与对照（分别记为D+与 D-)，采用诊断试验检测的结果可分别写成阳性与阴性（记为T+与T-)，资料可列成四格表 形式，如表1所示。表1中有四个可能结果，其中两个是正确的，即病例（肝硬化或肝癌患 者）被诊断为阳性（真阳性，TP)和对照（健康人）被诊断为阴性（真阴性，TN);两个是错 误的，即病例（肝硬化或肝癌患者）被诊断为阴性（假阴性，FN)和对照（健康人）被诊断 为阳性（假阳性，FP)。
[0103] 表1诊断资料2x2四格表。
【权利要求】
1. 检测人热休克蛋白gp96含量的物质在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断 疾病的预后的产品中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测人热休克蛋白gp96含量的物质 包含人热休克蛋白gp96和/或人热休克蛋白gp96的抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测人热休克蛋白gp96含量的 物质还包含通过酶联免疫吸附法测定人热休克蛋白gp96含量所需的试剂中除人热休克蛋 白gp96和人热休克蛋白gp96的抗体之外的试剂和所需的仪器。
4. 含有人热休克蛋白gp96编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌作为 制备人热休克蛋白gp96所需的生物材料在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断疾 病的预后的产品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述人热休克蛋白gp96的编码基因为如 下1)-3)任一所示： 1. SEQ ID No. 3所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码人热休克蛋白gp96的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码人热休克蛋白gp96的 DNA分子。
6. 含有人热休克蛋白gp96的抗体的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌或人热休克蛋白gp96的抗体的免疫原或抗原作为制备人热休克蛋白gp96的抗体所需 的生物材料在制备筛查或辅助诊断疾病的产品或辅助判断疾病的预后的产品中的应用。
7. 根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述疾病为肝硬化或肝癌。
8. -种筛查或辅助诊断疾病或辅助判断疾病的预后的试剂盒，该试剂盒包含检测人热 休克蛋白gp96含量的物质。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述检测人热休克蛋白gp96含量的物 质包含人热休克蛋白gp96和/或人热休克蛋白gp96的抗体。
10. 根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述疾病为肝硬化或肝癌； 所述试剂盒还包含使用说明书，说明书中记载如以下1)和/或2)和/或3)所示的内 容： 1) 以待测患者的血清为检测对象，如果待检血清中人热休克蛋白gp96含量< 70ng/ mL，该待测患者候选为非肝硬化患者或非肝癌患者；如果待检血清中人热休克蛋白gp96含 量彡220ng/mL并且<800ng/mL，该待测患者候选为肝硬化患者；如果待检血清中人热休克 蛋白gp96含量彡500ng/mL,该待测患者候选为肝癌患者； 2) 以肝硬化患者的血清为检测对象，待检血清中人热休克蛋白gp96含量<500ng/mL的 肝硬化患者预判断为5年内肝癌发病率低于待检血清中人热休克蛋白gp96含量> 500ng/ mL的肝硬化患者5年内肝癌发病率的肝硬化患者； 或， 血清中人热休克蛋白gp96含量<500ng/mL的肝硬化患者的5年内肝癌发病率低，血清 中人热休克蛋白gp96含量彡500ng/mL的肝硬化患者的5年内肝癌发病率高； 3) 以肝癌患者的血清为检测对象，待检血清中人热休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝 癌患者预判断为总生存期长于待检血清中人热休克蛋白gp96含量> 800ng/mL的肝癌患者 的总生存期的肝癌患者； 或， 血清中人热休克蛋白gp96含量<800ng/mL的肝癌患者的总生存期为2. 8±0. 7年，血 清中人热休克蛋白gp96含量彡800ng/mL的肝癌患者的总生存期为1. 2±0. 4年。
【文档编号】G01N33/68GK104330570SQ201410535528
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】孟颂东, 桂明明, 赵报 申请人:中国科学院微生物研究所