一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型及其构建方法和用途
【专利摘要】本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型及其构建方法和用途。本发明所述方法采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼，用于构建酒精性肝病的模型，通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少，以及荧光读数等信息，构建一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型，该模型具有观察指标简单，易于观察，可定性定量化等特点，特别适合应用于防治酒精肝药物的高通量筛选。
【专利说明】一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型及其构建方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型 及其构建方法和用途。
【背景技术】
[0002] 酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD)在病理组织学上分为酒精性脂肪 肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化，已成为影响人们健康的主要肝脏疾病之一。据 估计，90%长期过量饮酒者可发生脂肪肝，30% -37%可进展为酒精性肝纤维化及肝硬化， 并有5-15%患者即使戒酒仍可发生酒精性肝纤维化及肝硬化。在我国，酒精性肝病患者存 在饮酒年限久、日饮用量大的状况。据报道，在调查的902例酒精性肝病患者中，均匀饮酒 年限为22. 4年，均匀日摄入乙醇量128. 9克，日饮量最大为640克。这种长期大量的饮酒方 式，对我国酒精性肝病患者的肝脏造成了严重的损伤；上述患者中，酒精性肝炎患者占 ALD 的28. 8%，酒精性肝硬化患者占 ALD的37. 4%，预示我国面临着严重的酒精性肝病的威胁。 近年来，随着人们生活水平的不断提高和饮食结构的改变，酗酒人群大幅度的增加，发病率 呈明显上升趋势。因此，酒精性肝病在我国将成为一个严重的医学和社会问题，开展中医药 对ALD防治的研究具有重要意义。
[0003] 由于酒精性肝病病因复杂，临床上虽曾应用过多种类型的药物进行治疗，但至今 仍缺乏疗效确切的药物。因此，临床前有效药物的筛选显得至关重要。
[0004] 斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼，早先主要用于发育生物学研究，近年来被广 泛应用于生物学、医学和药物研发。作为一种新的药物研发用的模式动物，斑马鱼在临 床前药物筛选中具有以下诸多的优点：首先，斑马。鱼具有与人类高度相似的基因组，具 有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统，大量高度一致的活性代谢产物， 并呈现出与人类十分相似的生理学特征，一些已知的药物在斑马鱼上也出现了相似的治 疗效果，包括 sodiumnitroprussude，atrovastatin，Indomethacin, 5-aminosalicyclic acid, Prednisolone及etidronate等；其次，通过化学处理、遗传学等不同方法，研究人员 制造出了一系列的斑马鱼的人类疾病模型，可用于新药的筛选；最后，斑马鱼具有许多独特 的优势，例如，易于操作，体积小，可用于孔板的操作，药物化合物溶解加入即可，繁殖能力 强，每对鱼一周可产数百枚鱼卵，可提供大量的受试样本，生长发育迅速，3至4天主要器官 就已形成，成鱼2至3个月即可产卵，可缩短药物筛选的周期，提高筛选效率，养殖成本低， 其养殖成本约为小鼠的百分之一至千分之一，易于观察，其胚胎和幼鱼透明，可在显微镜下 实现活体观察各种器官、肿瘤细胞的迁移、心跳的节律变化及血液流动等。
[0005] 本发明采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼，用于构建酒精性肝病的模 型，通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少，以及荧光读数等信息，构建一种斑 马鱼酒精肝检测模型，该模型具有观察指标简单，易于观察，可定性定量化等特点，适合应 用于斑马鱼防治酒精肝药物的高通量筛选。
【发明内容】
[0006] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种简单的、可靠、高效的斑马鱼酒精 肝高通量检测模型及其建立方法和用途。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的公开了一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的 构建方法，包括如下步骤：
[0008] (1)选取肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼雌雄配对，按照常规方法进 行自然交配，收集肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵，备用；
[0009] (2)将收集的鱼卵用反渗透水冲洗，随后转移至鱼水中养殖，并向所述鱼水中加 入基于所述鱼水的添加量为〇. 2-0. 4ppm的亚甲基蓝，25-30-C培养，并向所述鱼水中加入 0. 1-0. 3mM 1-苯基-2-硫脲，继续培养至72hpf，随机收集已孵化的斑马鱼胚胎，分为对照 组和模型组，备用；
[0010] (3)在96hpf时，向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸 的浓度为〇. 002-0. 004 %，麻醉所述胚胎斑马鱼；；
[0011] (4)将模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为1-3%的乙醇溶液中，在密封条件 下于25-30°C继续孵育24-40h ;另取对照组的斑马鱼胚胎转移入水中，在密封条件下于 25-30°C继续孵育24-40h，得到斑马鱼酒精肝检测模型；
[0012] (5)取模型组和对照组的斑马鱼胚胎在荧光显微镜下测定肝脏、卵黄大小以及荧 光表达信号强度，对比模型组和对照组的斑马鱼胚胎的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达 信号强度，若所述模型组的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于对照组 的，则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型构建成功；反之，则不成功。
[0013] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（3)中，在制 备所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型过程中所使用的乙醇的质量浓度为2%。
[0014] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（3)中，所述 胚胎斑马鱼在28?培养箱中孵育32h。
[0015] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（3)中，向鱼 水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸浓度为〇. 003%。
[0016] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（2)中，所采 用的亚甲基蓝基于所述鱼水的添加量为〇· 3ppm。
[0017] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（2)中，向所 述鱼水中加入0. 2mM 1-苯基-2-硫脲。
[0018] 所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，在所述步骤（1)中，在所 述成年肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼以雌雄比为1:1配对进行交配，并以产卵开 始计时，在30分钟内收集所述肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵。
[0019] 本发明提供了一种由上述的建立方法制备得到所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量 检测模型。
[0020] 本发明提供了一种所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型用于评价或筛选用 于治疗酒精肝的药物的用途。
[0021] 本发明提供了一种利用所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精 肝的药物的方法，具体包括如下步骤：
[0022] 1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型，并向其中加入浓度1-25 μ Μ的待测 化合物，于25-30°C恒温条件下培养36-60h，得到给药斑马鱼模型；
[0023] 2)将所述给药斑马鱼进行分析，计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积，并测 定其荧光表达信号强度，若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号 强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低10-30%，则所述待测化 合物具有防治酒精肝的作用。
[0024] 优选的，所述利用所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝的药 物的方法，具体包括如下步骤：
[0025] 1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型，并向其中加入浓度?ο μ Μ的待测化 合物，于2S°C恒温条件下培养48h，得到给药斑马鱼；
[0026] 2)将所述给药斑马鱼进行分析，计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积，并测 定其荧光表达信号强度，若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号 强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低20%，则所述待测化合物 具有防治酒精肝的作用。
[0027]本发明采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼，用于构建酒精性肝病的模 型，通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少，以及荧光读数等信息，构建一种斑 马鱼胚胎酒精肝检测模型，该模型具有观察指标简单，易于观察，可定性定量化等特点，适 合应用于斑马鱼防治酒精肝药物的高通量筛选，且肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼 在酒精处理后出现胎肝脏外形肿大，卵黄吸收减少，荧光读数增加，这些指标和酒精性肝病 的病理切片、油红0染色以及生化分子生物学指标相一致。
[0028] 效果例
[0029] 本实施例仅以实施例3制备的所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型为研究对 象，考察本发明所述的斑马鱼胚胎酒精肝模型的评价指标，即肝脏的面积、卵黄的面积以及 荧光表达信号强度的增加与现有技术中的斑马鱼胚胎酒精肝模型常规评价指标即油红染 色、病理切片以及斑马鱼胚胎酒精肝模型的脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因表达异常等 结果的相关性，进一步验证肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的增加可作为 评价斑马鱼胚胎酒精肝模型是否成立的可靠指标。
[0030] 以实施例3制备的所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型进行常规的油红染色、 病理切片，具体步骤如下：
[0031] 斑马鱼胚胎酒精肝的油红0染色
[0032] 分别向对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼 胚胎中加入三卡因甲磺酸直至溶液中所述三卡因甲磺酸浓度为〇. 003%，麻醉所述斑马鱼 胚胎后，分别用质量浓度为4%的多聚甲醛（PFA)固定，室温条件下固定2-4h，然后分别用 pH为7. 4的PBS缓冲液冲洗三次，每次2分钟，然后分别将所述斑马鱼胚胎储存在pH为 7. 4的PBS缓冲液中，4°C冰箱中保存；染色时，取出所述斑马鱼胚胎用pH为7. 4的PBS缓 冲液冲洗两次，然后用巴斯德吸管将所述斑马鱼胚胎转移至Corning Netwells (如果斑马 鱼胚胎粘住吸管，用含〇·〇5%吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液（PBST)反复轻微洗 涤几次，需要最小化PBST的接触时间），然后再用pH为7. 4的PBS快速洗五次，每次5分 钟。用质量浓度为85%的丙二醇处理所述斑马鱼胚胎lOmin，然后再用质量浓度为100% 的丙二醇处理lOmin，彻底滤千水分后，将所述斑马鱼胚胎放入含油红0(0il Red 0)的质 量浓度为100%的丙二醇中，于室温条件下轻微晃动过夜，然后用质量浓度为100%的丙二 醇洗所述斑马鱼胚胎30min，然后再用质量浓度为85%的丙二醇洗50min，最后用质量浓度 为85%的丙二醇洗40min。向所述斑马鱼胚胎中加入等量的 PH为7. 4的PBS缓冲液，轻微 摇晃5min,直至均匀，然后转移到pH为7. 4的roS中，洗15min后，再次用pH为7. 4的PBS 洗5min，将所述斑马鱼胚胎转移回玻璃管中（如果胚胎粘住吸管，用〇· 〇5%的PBST反复轻 微洗涤几次，需要最小化PBST的接触时间），用PH为7. 4的PBS快速洗5min,然后加入适 量80%甘油，室温储存。分别从对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组 的所述斑马鱼胚胎中随机挑选10-20条，及时用显微镜观察所述斑马鱼胚胎的肝脏脂肪染 色情况（肝脏脂肪滴数多3评判为脂肪肝），并做好记录。
[0033]斑马鱼胚胎肝脏大小及卵黄吸收的显微镜拍照及测定
[0034]将肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼胚胎直接放置于显微镜下观察肝脏及 卵黄大小，并拍照记录和保存图片。然后用图像处理软件进行图像分析，计算肝脏大小及卵 黄吸收情况。
[0035] 斑马鱼胚胎的肝脏病理切片：
[0036] 分别取对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼 胚胎置于Bouin氏溶液中固定24-48h，然后将所述斑马鱼胚胎置于流水中冲洗约2h，随后 经过不同浓度的乙醇脱水（50%乙醇脱水2h以上，70%乙醇脱水2h以上，80%乙醇脱水 2h，90 %乙醇脱水1. 5h，95 %乙醇脱水1. 5h，无水乙醇脱水40min)，将脱水后的斑马鱼胚胎 使用体积比为1:1的乙醇：二甲苯处理lh，再用二甲苯处理lOmin，之后用体积比为1:1的 二甲苯：石赌浸泡lh，再用石錯浸泡40min至lh,将所述斑马鱼胚胎从石蜡中取出，置于包 埋盒中，倒入石蜡，进行包埋，然后在切片机上切片，切片厚度设置为4-8um。将切好的薄片 轻轻放入38°C水浴中，完全开展后，将它转移至涂有甘油蛋白的载玻片上，放入60?的恒 温箱中烘干约12h，取出所述载玻片先后经二甲苯脱蜡lOmin，无水乙醇脱蜡lmin，95%乙 醇处理脱蜡lmin，90 %乙醇脱蜡lmin，80 %乙醇脱蜡lmin，70 %乙醇脱錯lmin后，进行苏木 精-伊红染色，具体染色步骤为：苏木精染液染色lOmin，随后分别用蒸馏水和盐酸乙醇分 化清洗片刻，流水继续冲洗lOmin以上，70%乙醇冲洗lmin， 8〇%乙醇冲洗lmin，95%乙醇 冲洗lmin，再在伊红染液中染色lmin，进入脱水阶段，用95%乙醇脱水lmin，100%的无水 乙醇脱水lmin，二甲苯脱水5min，最后将中性树胶滴于所述载玻片上，随即将盖玻片轻轻 放置于载玻片上，防止产生气泡。10尾斑马鱼胚胎的切片，每尾随机挑选10个切片，然后在 每个切片组织上随机选取10个lOOumXIOOum的区域进行肝脏细胞外形的显微观察，并记录 相应的结果。
[0037]斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度的增加与油 红染色及病理切片的相关性结果
[0038] 研究发现，与未进行酒精处理的斑马鱼胚胎相比（对照组），实施例3制备的斑马 鱼胚胎酒精肝模型（模型组）的肝脏肿大倍数，卵黄吸收变慢倍数以及荧光读数增加倍数 分别为1. 52±0. 22,3. 82±0. 46和1. 48±0. 27(见下表1)。而油红染色及病理切片结果显 示，油红0染色阳性率（％)和病理切片不正常细胞百分比（％)分别从8. 1 土3. 2增加到 70. 2±8. 1和从3. 2±0. 8增加到60. 9±5. 2(见下表1)。上述结果表明，斑马鱼胚胎酒精 肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加与油红染色及病理切片结果相一致，从而验 证了斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加等简易指标可用于斑 马鱼胚胎酒精肝模型的检测。
[0039] 表1.斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加与油红染色 及病理切片结果
[0040]
【权利要求】
1. 一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 选取肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼进行雌雄配对，按照常规方法进 行自然交配，收集肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵，备用； (2) 将收集的鱼卵用反渗透水冲洗，随后转移至鱼水中养殖，并向所述鱼水中加入 基于所述鱼水的添加量为〇. 2-0. 4ppm的亚甲基蓝，25-30°C培养，并向所述鱼水中加入 0. 1-0. 3mM 1-苯基-2-硫脲，继续培养至72hpf，随机收集已孵化的斑马鱼胚胎，分为对照 组和模型组，备用； (3) 在96hpf时，向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓 度为0. 002-0. 004%，麻醉所述胚胎斑马鱼； (4) 将模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为1-3 %的乙醇溶液中，在密封条件下于 25-30°C继续孵育24-40h ;另取对照组的斑马鱼胚胎转移入水中，在密封条件下于25-30°C 继续孵育24-40h，得到斑马鱼酒精肝检测模型； (5) 取模型组和对照组的斑马鱼胚胎在荧光显微镜下测定肝脏及卵黄大小，对比模型 组和对照组的斑马鱼胚胎的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度，若所述模型组的 肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于对照组的，则所述斑马鱼胚胎酒精 肝高通量检测模型构建成功；反之，则不成功。
2. 根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特征在 于，在所述步骤（3)中，在制备所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型过程中所使用的乙 醇的质量浓度为2%。
3. 根据权利要求1或2所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特征 在于，在所述步骤（3)中，所述胚胎斑马鱼在28°C培养箱中孵育32h。
4. 根据权利要求1-3任一所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特 征在于，在所述步骤（3)中，向鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸浓 度为 0· 003%。
5. 根据权利要求1-4任一所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特 征在于，在所述步骤（2)中，所采用的亚甲基蓝基于所述鱼水的添加量为0.3ppm。
6. 根据权利要求1-5任一所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特 征在于，在所述步骤（2)中，向所述鱼水中加入1-苯基-2-硫脲0. 2mM。
7. 根据权利要求1-6任一所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法，其特 征在于，在所述步骤（1)中，在所述成年肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼以雌雄比 为1:1配对进行交配，并以产卵开始计时，在30分钟内收集所述肝脏特异表达绿色荧光的 转基因斑马鱼鱼卵。
8. 根据权利要求1-7任一所述的建立方法制备得到所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量 检测模型。
9. 一种权利要求8所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型用于评价或筛选防治酒 精肝药物的用途。
10. -种利用权利要求8所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝药 物的方法，其特征在于，具体包括如下步骤： 1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型，并向其中加入浓度1-25 μ Μ的待测化合 物，于25-30°C恒温条件下培养36-60h，得到给药斑马鱼模型； 2)将所述给药斑马鱼进行分析，计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积，并对其荧 光表达信号强度进行读数，若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信 号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低10-30%，则所述待测 化合物具有防治酒精肝的作用。
11.根据权利要求10所述的筛选防治酒精肝药物的方法，其特征在于，具体包括如下 步骤： 1) 取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型，并向其中加入浓度10 μ Μ的待测化合 物，于28°C恒温条件下培养48h，得到给药斑马鱼； 2) 将所述给药斑马鱼进行分析，计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积，并对其荧 光表达信号强度进行读数，若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信 号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低20%，则所述待测化合 物具有防治酒精肝的作用。
【文档编号】G01N21/64GK104297222SQ201410548844
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】陈志亮, 罗志毅, 殷婷婷, 徐毅敏, 郑玉清 申请人:漳州片仔癀药业股份有限公司