一种检测抗cd52抗体的elisa反应体系与方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测抗CD52抗体的ELISA反应体系和方法，该方法包括构建CD52抗原多肽并对该抗原进行修饰，将该抗原进行包板捕捉样品中抗CD52单抗，再通过进一步结合酶联抗体，并通过加入合适底物而显色，再通过与已知浓度标准品的对比，从而测出样品中抗体的含量。本发明提供的用于检测抗CD52抗体的ELISA反应体系与方法，该反应体系与方法可用于检测培养上清液和生物样本中抗CD52抗体的含量，本方法具有高度专属性，生物样本中的检测灵敏度可达到0.1ug/ml。
【专利说明】-种检测抗CD52抗体的ELISA反应体系与方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测抗CD52抗体的ELISA反应体系与方法。该反应体系与 方法可用于检测培养上清液和生物样本中抗CD52抗体的含量，本方法具有高度专属性，生 物样本中的检测灵敏度可达到0. lug/ml。
【背景技术】
[0002] Alemuzumab (抗⑶52抗体，Campath-IH)是重组DNA转染的CHO细胞表达的抗 CD52人源化的单克隆抗体，具有人抗体构架区和恒定区及鼠源的互补性决定区（CDR)的 IgGl kappa抗体。抗体构建是将抗人CD52鼠源单克隆抗体（rat YTH 34. 5HL，Campath-IG) 的重链和轻链的CDR分别插入到人的IgGl重链和轻链可变区，替换人源抗体的CDR。 Alemtuzumab最早被批准用于慢性淋巴细胞白血病的治疗，具有显著的治疗效果。由于其特 殊的作用机理，后续广泛开展了多项自身免疫相关的临床试验，包括多发性硬化、GVHD等。 其中Alemtuzumab针对多发性硬化的治疗已经被欧盟、加拿大等国家或地区的监管机构批 准。
[0003] Alemtuzumab可特异性识别细胞表面⑶52抗原，在淋巴细胞分化过程中，淋巴细 胞表面表达⑶52抗原，单个细胞表面可表达约5xl05⑶52分子，构成抗体进攻淋巴细胞很 好的靶点。⑶52由12个氨基酸残基组成，Asn-3是N-连接糖基化位点，抗原与细胞膜结合 位点是C-末端Ser-12,通过糖脂键连接细胞膜。纯化的抗原组分不一致(糖基化）其分子 量21-28kD，N-Glycanase或Pronase处理后，分子量减少至6kD。⑶52抗原分子非常小，并 具有糖脂性，抗原决定簇靠近细胞膜，这些结构决定CD52抗原是很好的药物靶点。
[0004] ⑶52抗原分子较小，难以直接用于ELISA检测。另外Alemtuzumab分子主要组 成部分为人IgGl区域，而且各哺乳动物物种间IgGl的同源性非常高，因此对于生物样 本中Alemtuzumab的特异性检测一直欠缺特异性。Rebello P.等在Pharmacokinetics of CAMPATH-1H: assay development and validation. J Immunol ife从00? 2002?中 描述了一种基于HUT-78细胞系的检测方法，但是基于细胞的检测误差较大，一般认为 会达到±25%，而且这种方法操作复杂，准备时间较长。Iman Jilani等描述了一种基 于 Alemtuzumab 中鼠源性 CDR 区的 ELISA 检测方法 Alemtuzumab: validation of a sensitive and simple enzyme-linked immunosorbent assay. Leukemia Research 2004。该方法一定程度上提高了检测的灵敏度，但稳定性较差。
【发明内容】
[0005] 本发明建立了一套检测抗⑶52抗体的ELISA反应体系和方法，包括构建⑶52多 肽抗原并对该抗原进行修饰，将该抗原进行包板捕捉样品中抗CD52抗体，再通过进一步结 合标记抗体如酶联抗体，并通过加入合适底物而显色，通过与已知浓度标准品的对比，从而 测出样品中抗体的含量。该方法检测限值为〇. lug/ml，检测范围0. l~30ug/ml。
[0006] 本发明的一种检测抗⑶52抗体的ELISA检测方法，通常主要包括：合成⑶52多肽 抗原并对该多肽抗原进行修饰，将该多肽抗原配置成抗原溶液，包被于酶标板上；之后使用 洗涤液洗板，甩干后加入封闭液，然后再用洗涤液洗板；使用待测样品缓冲液如PBST或相 应血清稀释待测生物样本，稀释浓度根据待测生物样本进行选取和调节，如KT5O倍稀释， 之后加样，加完样的酶标板静置反应，之后弃液，用洗涤液洗板；再加入标记抗体如酶联抗 体进行反应，之后洗板；然后加入显色液、终止液终止反应后将酶标板放至酶标仪内，0D450 读数。然后通过与已知浓度标准品的对比，从而测出样品中抗⑶52抗体的含量。
[0007] 本ELISA检测方法的重要部分是⑶52多肽抗原的合成与修饰。⑶52序列为 (1-61): MKRFLFLLLT ISLLVMVQIQ TGLSGQNDTS QTSSPSASSN ISGGIFLFFV ANAIIHLFCFSjjf 述CD52多肽抗原的合成，其氨基酸序列为包含XTSQTX或XQTSSX的多肽或蛋白序列，其中 X代表任意氨基酸序列，特别是GQNDTSQTSSPS，为选取的12个氨基酸的抗体识别区，第25 至36个氨基酸：GQNDTSQTSSPS，对其进行人工合成。由于人工合成的抗原区域分子量较小， 难以进行包板，因此对该人工合成的抗原进行偶联含有-OH基-SH基团的标签蛋白如牛血 清白蛋白（BSA)修饰。牛血清白蛋白（BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含 583个氨基酸残基，分子量为66. 430 kDa，等电点为4. 7。牛血清白蛋白在生化实验中有广 泛的应用，例如在western blot中ELISA等中作为Blocking剂；在酶切反应缓冲液中加入 BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用；防止酶的分解和非特异性吸附，能减 轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。BSA 比较稳定，常用于各种生物学反应中，作为蛋白保护剂及载体。除使用牛血清白蛋白之外， 也可使用其他偶联物进行化学修饰，例如但不限于为BSA，PEG，PEI，GST，MBP等含有-OH 基-SH基团的标签蛋白，直链或支链淀粉糖类，脂质体，琼脂糖等疏水性载体。
[0008] 本发明中与已知浓度标准品的对比为与已知浓度标准品曲线进行对比，优选通过 使用抗CD52抗体标准品与待测生物样本进行平行试验，获得已知浓度标准品曲线。具体 地，通过使用含PBST的空白对照样品梯度稀释⑶52抗体标准品，并加样，加样后的酶标板 按照上述同样步骤进行反应操作，并0D450读数，根据所有读数通过逻辑拟合获得标准曲 线。该标准曲线要求R2 > 0.98。其中，⑶52抗体标准品的稀释，通常按如下梯度：从40ug/ ml开始共做9个梯度，依次3倍稀释。
[0009] 待测样品缓冲液为常用缓冲液，如磷酸盐缓冲液等，或用相应血清代替，相应血清 为待测生物样本的血清，如猴、人、大鼠等； 所述生物样本，可以为人或动物血清(血浆)、发酵培养上清液等。
[0010] 所述包被于酶标上的包板条件，为使用2. 5 y g/ml的⑶52多肽抗原溶液，并于4°C 冰箱放置过夜。
[0011] 所述洗板的洗涤液，为磷酸钠盐（pH 7. 4±0. 2)，洗板次数通常可以为2-6次。
[0012] 所述的封闭液为：5%脱脂奶粉或BSA或其他常用封闭液。
[0013] 所述稀释步骤后的加样过程，加样时每个样品做2个复孔，每孔lOOyl。
[0014] 所述标记抗体为发光物质标记的人IgG抗体，其标记物包括但不限于辣根过氧化 物酶（HRP)、生物素（Biotin)、异硫氰酸荧光素（FITC)、碱性磷酸酶（AP)等，其检测形式可 以是化学发光、荧光、常规可见光等。抗人IgG抗体可以常用的哺乳动物制备抗体，如兔抗、 鼠抗、羊抗等，也可以是重组的IgG抗体。一个非限制性例子例如：所述标记抗体为酶联抗 体，具体例如但不限于为为酶联标记的兔抗人IgG。此外，所述酶联抗体也可用其他标记的 多种抗人IgG。
[0015] 所述加完样的酶标板的静置反应为抗体抗原结合反应，其反应温度为31-37°C，时 间通常是1-4小时。
[0016] 所述的显色液为TMB(3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺)，显色反应时间为5-30min，反应 温度为31-37°C ;所述终止液为95%浓硫酸。
[0017] -种用于检测抗⑶52抗体的ELISA反应体系，主要包括以下组分：人工合 成并经过化学修饰的CD52多肽抗原，标记抗体，包被液，封闭液，洗涤液，酶标板，TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）显色液，终止液，待测样品缓冲液或相应血清，待测生物样本。
[0018] 该反应体系的包被液为磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液可以配制得到，一个非限 制性例子如：配制时称取碳酸钠I. 272g，碳酸氢钠2. 344g，加去离子水至30ml，然后调pH 至9. 4,加去离子水定容至40ml。保存于4°C冰箱，稀释10倍使用。
[0019] 该反应体系的封闭液为脱脂奶粉或BSA或其他常用封闭液。
[0020] 所述洗涤液为PBST (磷酸钠盐）洗涤液。
[0021] 该反应体系的标记抗体为发光物质标记的人IgG抗体，其标记物包括但不限于辣 根过氧化物酶（HRP)、生物素（Biotin)、异硫氰酸荧光素（FITC)、碱性磷酸酶(AP)等，其检 测形式可以是化学发光、荧光、常规可见光等。抗人IgG抗体可以常用的哺乳动物制备抗 体，如兔抗、鼠抗、羊抗等，也可以是重组的IgG抗体。一个非限制性例子例如：可使用IOul HRP标记的兔抗人IgG原液加入到90ul PBS中震荡混匀得1:10酶联抗体。
[0022] 该反应体系的终止液用途是终止显色反应，并且提高显色的稳定性，便于检测。例 如HRP显色体系的终止液可以是2M硫酸，AP显色终止液可以是NaOH。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下： 本发明提供了一种用于检测抗CD52抗体的ELISA反应体系与方法，该反应体系与方法 可用于检测培养上清液和生物样本中抗CD52抗体的含量，本方法具有高度专属性，生物样 本中的检测灵敏度可达到0. lug/ml。
[0024] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明实施例1的标准曲线； 图2是本发明实施例1的样品测试曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发 明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改 进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0027] 实施例1 本实施例以HRP标记的兔抗人IgG酶联抗体检测食蟹猴血清中抗CD52抗体为例说明 本发明的ELISA反应体系与方法。
[0028] 该方法具体步骤如下： 第一步，包板（Coating):取25 ii I lmg/ml的人工合成并经过化学修饰的⑶52多肽 抗原，加入到IOml包被液中混匀，配成浓度为2. 5 ii g/ml的抗原溶液，包被于酶标板上， 100 Ul/孔，于4°C冰箱放置过夜。所述人工合成并经过化学修饰的⑶52多肽抗原为选取 12个氨基酸的抗体识别区为第25至36个氨基酸：GQNDTSQTSSPS进行人工合成，并进行偶 联牛血清白蛋白（BSA)修饰得到的。所述包被液为磷酸盐缓冲液。
[0029] 第二步，封闭（Blocking):弃去孔中液体，使用洗漆液洗板3次，每次150rpm震荡 lmin，甩干后加入250 iil/孔的封闭液，放37°C培养箱，作用3小时，再用洗涤液洗3次，每 次150rpm震荡lmin。所述洗涤液为PBST (磷酸钠盐)洗涤液。所述封闭液为5%脱脂奶粉 或BSA或其他常用封闭液。
[0030] 第三步，标准品的稀释：用含29T10%食蟹猴血清的PBST模拟待测样品环境，梯度 稀释抗⑶52抗体标准品：取8ul 2mg/ml⑶52抗体标准品加入到400ul 10%血清的PBST 中浓度为40ug/ml，取IlOul 40ug/ml抗CD52抗体加入到220ul 10%血清的PBST中稀释为 13. 33ug/ml，依次3倍稀释。从40ug/ml开始共做9个梯度。每个浓度做2个复孔。
[0031] 第四步，样品稀释：用PBST将待测生物样品1(T50倍稀释，加样时每个样品做2个 复孔，每孔IOOu 1。
[0032] 第五步，反应：加完样的酶标板放37°C培养箱，静置2小时进行抗原抗体结合反 应。之后弃液，用洗涤液洗板3次，每次150rpm震荡lmin。取1:100酶联抗体20ul，用PBST 稀释500倍，混匀后每孔100 ill加至酶标板中，放37°C培养箱，反应1小时。弃液，用洗涤 液洗板3次，每次150rpm震荡lmin。在干净吸水纸上拍干。所述酶联抗体为HRP标记的兔 抗人IgG酶联抗体。
[0033] 第六步，显色、终止、读数：每孔加入TMB IOOiil，放37°C培养箱，反应IOmin显色。 之后每孔加入终止液50iU，终止反应。将酶标板放至酶标仪内，0D450读数。所述终止液 为95%浓硫酸。
[0034] 按照上述方法进行食蟹猴血清中抗⑶52抗体检测，得到食蟹猴血清中抗⑶52抗 体标准曲线和待测样品的OD值如下表1。
[0035] 表 1
【权利要求】
1. 一种检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，包括合成CD52多肽抗原并 对该CD52多肽抗原进行修饰，将该修饰后的CD52多肽抗原进行包板捕捉样品中抗CD52抗 体，再进一步结合标记抗体，并通过加入显色液、终止液而显色，然后通过与已知浓度标准 品的对比，测出样品中抗CD52抗体的含量。
2. 如权利要求1所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述CD52多 肽抗原的合成，其氨基酸序列为包含XTSQTX或XQTSSX的多肽或蛋白序列，其中X代表任 意氨基酸序列。
3. 如权利要求2所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述X为选 取的12个氨基酸的抗体识别区，第25至36个氨基酸：GQNDTSQTSSPS，对其进行人工合成。
4. 如权利要求1或2或3所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，对 所述多肽抗原进行修饰的方法为：对所述多肽抗原进行偶联含有-0H基-SH基团的标签蛋 白的修饰。
5. 如权利要求4所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述含有-0H 基-SH基团的标签蛋白选自牛血清白蛋白，聚乙二醇，聚乙烯亚胺，谷胱甘肽巯基转移酶， 麦芽糖结合蛋白，直链或支链淀粉糖类，脂质体，琼脂糖的一种或几种。
6. 如权利要求1所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，将修饰后的 ⑶52多肽抗原进行包板捕捉样品中抗⑶52抗体的方法为：将⑶52多肽抗原配置成⑶52多 肽抗原溶液，包被于酶标板上；使用洗涤液洗板，甩干后加入封闭液；使用待测样品缓冲液 或相应血清稀释待测生物样本，并加样；加完样的酶标板静置反应后，弃液，用洗涤液洗板。
7. 如权利要求6所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述静置反 应为抗体抗原结合反应，其反应温度为31-37°C，时间是1-4小时。
8. 如权利要求1所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述标记抗 体为发光物质标记的人IgG抗体。
9. 如权利要求1或8所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述标 记抗体为酶联标记的兔抗人IgG。
10. 如权利要求1所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述的显色 液为TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺)，显色反应时间为5-30min，反应温度为31-37°C ;所 述终止液为95%浓硫酸。
11. 如权利要求1所述的检测抗CD52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述与已 知浓度标准品的对比为与已知浓度标准品曲线的对比，所述已知浓度标准品曲线的R2 > 0. 98 〇
12. 如权利要求1所述的检测抗⑶52抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述ELISA 检测方法的限值为0. lug/ml，检测范围0. l~30ug/ml。
13. -种用于检测抗⑶52抗体的ELISA反应体系，其特征在于，主要包括以下组分：人工合成并经过化学修饰的CD52多肽抗原，标记抗体，包被液，封闭液，洗涤液，酶标板， 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺显色液，终止液，待测样品缓冲液或相应血清，待测生物样本。
14. 如权利要求13所述的用于检测抗CD52抗体的ELISA反应体系，其特征在于，所述 人工合成并经过化学修饰的CD52多肽抗原通过选取12个氨基酸的抗体识别区为第25至 36个氨基酸：GQNDTSQTSSPS，并进行人工合成，之后偶联含有-OH基-SH基团的标签蛋白得 到。
【文档编号】G01N33/558GK104360057SQ201410566000
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】齐念民, 王鹏, 庄超, 曾晨 申请人:上海泰因生物技术有限公司