抗s-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶体金试纸、试剂盒及用途

抗s-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合物、胶体金试纸、试剂盒及用途
【专利摘要】本发明提供了一种特异性结合S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体301或者其抗原结合部分、产生其的杂交瘤、包含该单克隆抗体301或者其抗原结合部分的组合物或试剂盒，试纸条。与此同时，本发明还提供了使用上述单克隆抗体301或者其抗原结合部分、其组合物或试剂盒来检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或者其水平的非治疗或诊断目的的方法和其用途。该细胞株及其产品第一次使得免疫方法检测生命代谢活动过程中甲基化指数(即S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的比值)成为可能。本发明中获得的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体细胞株将有很大的实用性和应用前景。CCTCC C201417820140915
【专利说明】抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体301、其杂交瘤、组合 物、胶体金试纸、试剂盒及用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明主要涉及可特异性识别和结合S-腺苷同 型半胱氨酸的单克隆抗体或其功能性片段、其杂交瘤、组合物、试剂盒及用途。

【背景技术】
[0002] LS-腺苷同型半胱氨酸
[0003] 蛋氨酸分子含有硫⑶甲基，在与ATP作用生成-腺苷蛋氨酸 (S-AdenosyI-Lnethionine，SAM)后，可通过各种转甲基作用为体内已知的约50多 种具有重要生理活性的物质（DNA，RNA，蛋白，磷脂，激素，神经递质等等）提供甲 基。SAM是这些生命活动中重要生理活性物质甲基化调控中唯一的甲基提供者。S腺 苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成S-腺苷同型半胱氨酸 (S-Adenosyl-L-homocysteine, SAH)，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸（Hcy)。而同 型半胱氨酸则可通过N5甲基四氢叶酸转甲基酶（EC1. I. 1. 68)及其辅酶维生素 B12的催化 作用，接受N5甲基四氢叶酸提供的甲基，重新生成蛋氨酸。而此过程又是已知的体内能利 用N5甲基四氢叶酸的唯一反应。另外，同型半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（EC4. 2. 1.22) 催化下也可与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者近一步生成半胱氨酸和α酮丁酸。
[0004] 2.生物体的甲基化指数
[0005] 生物体中甲基化指数被定义为SAM和SAH的比值。甲基化指数是一个能够客观地 反应人体甲基化程度的指标。从以上可以看出SAH和Hcy是连接提供甲基给生命活性物质 和从甲基四氢叶酸回收甲基给活性甲基供体的SAM之间的重要桥梁。他们含量的高低将 会直接决定或反映一碳代谢和蛋氨酸循环过程正常与否的重要指标。因此，找到准确定量 SAH和Hcy的方法，甚至定量所有参与一碳代谢和蛋氨酸循环的物质的含量，将具有很大的 实际意义。研究表明，SAH升高能导致血管内皮细胞的损伤，且这种作用与整体基因组甲基 化水平有关，SAH可能是动脉粥样硬化形成过程中的潜在生物标志分子。
[0006] 目前S-腺苷同型半胱氨酸主要的检测方法是高效液相（HPLC)方法，荧光偏振免 疫检测（FPLA)方法以及LC-MS/MS。研发SAH特异性的单克隆抗体从而使免疫检测成为可 能，为测量生物体内的甲基化指数开辟了实际而可行的途径，已有研究表明，甲基化指数能 够比较准确地反映人体内甲基化状态（与生命过程中重要的过程直接相关，涉及到出生， 衰老，癌变，退化等等），而且它与疾病和健康又很大的相关性。因而，本发明具有较大的实 用意义。
[0007] 3.现有技术中的SAH单克隆抗体
[0008] 在勾宏霞等人发表于2005年的论文（中华检验医学杂志，2005年1月，第28卷 第1期，第92-95页）中指出，通过制备SAH-BSA偶联物和SAH单克隆抗体，建立了同型半 胱氨酸（Hcy)的免疫学测定方法。其中制备的SAH-BSA偶联物的克分子比为3?5,结果显 示SAH单克隆与腺苷、半胱氨酸、蛋氨酸等无交叉反应，但是与S-腺苷蛋氨酸（SAM)存在交 叉反应。据此作者认为其制得了 SAH的单克隆抗体，但是作者也指出该单抗对SAM表现出 一定的交叉反应。该文实际上不是定量SAH，而是定量Hcy的含量。因此，按照此方法，无法 得到生物体的甲基化指数。
[0009] 除此之外，美国abeam公司有兔抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体出售。该抗体 与类似物（S-腺苷蛋氨酸，腺苷，同型半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，胱硫醚）的交叉反应 较小。但是该兔抗SAH单抗的检测下限高于260nM，这一检测下限较高，限制了需要高灵敏 高的检测情况。该抗体无法用于测定血浆样品，在竞争性酶联免疫吸附试验中，我们观察到 了非特异性抑制反应，使得该株抗体无法用于EDTA抗凝的血浆样品。因此，这种市售单克 隆抗体由于灵敏度较低的限制和不适用于血浆样品，也不适合用于测量甲基化指数。
[0010] 4.单克隆抗体技术
[0011] 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，选择性表达出不同基因的B淋巴细胞 合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同 基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量 的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种 专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克 隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
[0012] 单克隆抗体技术自从上世纪70年代发明以来，技术已经非常成熟。应用于许多领 域，作为有用的检测或治疗工具。用于检测小分子的单克隆抗体，由于小分子的特性不同， 抗体制备有一定的技术难点和特殊性。一般而言，小分子的抗原需要耦联合适的大分子载 体，作为免疫原，才能在动物体内引起足够强的免疫反应，从而产生抗体。
[0013] 克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化 抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培 养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的 肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺 的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清 中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 100 到 1000 倍。


【发明内容】

[0014] 因此，本发明的目的是提供一种特异性更高、灵敏度也更高的单克隆抗体，从而为 SAH的检测提供更好的工具。
[0015] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织 培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常 规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0016] 如本文中所使用的，术语"抗体"是指通常由两对相同的多肽链（每对具有一条 "轻"（L)链和一条"重"（H)链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和λ轻 链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、 IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的"J"区连接， 重链还包含大约3个或更多个氨基酸的"D"区。各重链由重链可变区（VH)和重链恒定区 (CH)组成。重链恒定区由3个结构域（CHI、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区（VL) 和轻链恒定区（CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫 球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统 的第一组分（Clq)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域（称为互补决定 区（CDR))，其间散布有较保守的称为构架区（FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、 ⑶RU FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个⑶R和4个FR组成。 各重链/轻链对的可变区（VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的 分配遵循 KabatSequencesofProteinsoflmmuno Iogi cal Interest (NationalInstitutesofH ealth，Bethesda，Md. (1987andl991))，或 Chothia&Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917 ; Chothia等人（1989)Nature342 :878-883的定义，其均以全文结合于此作为参考。术语"抗 体"不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和 多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgGl，IgG2, IgG3或IgG4亚 型），IgAl, IgA2, IgD，IgE 或 IgM 抗体。
[0017] 如本文中所使用的，术语抗体的"抗原结合部分"是指全长抗体的一个或多个部 分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原（例如，ERCC1)的能力，与完整抗体竞争对 抗原的特异性结合。通常参见，Fundamentallmmunology，Ch. 7(Paul，W.，ed.，第 2 版， RavenPress，N. Y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA 技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分 包括Fab、Fab'、F(ab'）2、FcU Fv、dAb和互补决定区（CDR)片段、单链抗体（例如，scFv)、 嵌合抗体、双抗体（diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的 抗体的至少一部分。
[0018] 如本文中所使用的，术语"Fd片段"意指由VH和CHl结构域组成的抗体片段；术 语"Fv片段"意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语"dAb片段"意指 由VH结构域组成的抗体片段（Ward等人，Nature341 :544-546(1989));术语"Fab片段"意 指由VL、VH、CL和CHl结构域组成的抗体片段；术语"F(ab'） 2片段"意指包含通过铰链区 上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
[0019] 在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体（例如，scFv)，其中VL和 VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子（参见，例如， Bird 等人，Science242 :423-426(1988)和 Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 : 5879-5883(1988)，其以全文结合于此作为参考）。此类scFv分子可具有一般结构： NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS 氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列（GGGGS)4的接头，但也可使用 其变体（Holliger 等人（1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444-6448)。可用于本发 明的其他接头由 Alfthan 等人（1995)，ProteinEng. 8 :725-731, Choi 等人（2001)，Eur. J.Immunol. 31 :94-106, Hu 等人（1996)，CancerRes. 56 :3055-3061，Kipriyanov 等人 (1999)，J. Mol. Biol. 293 :41_56 和 Roovers 等人（2001), CancerTmmunol.描述，其以全文 结合于此作为参考。
[0020] 在一些情况下，抗体是双抗体，S卩，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链 上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构 域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位（参见，例如，HolligerP. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444-6448 (1993),和 Pol jakR. J.等人，Structure〗： 1121-1123(1994)，其以全文结合于此作为参考）。
[0021] 可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂 法）从给定的抗体获得抗体的抗原结合部分（例如，上述抗体片段），并且以与对于完整抗 体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
[0022] 如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体 相同。
[0023] 如本文中所使用的，术语"杂交瘤"和"杂交瘤细胞株"可互换使用，并且当提及"杂 交瘤"和"杂交瘤细胞株"时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
[0024] 在本发明的一个方面，提供了一种特异性结合S-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗 体301或者其抗原结合部分，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株301产生；并且所述的杂交瘤 细胞株301保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山， 保藏编号为：CCTCC C2014178,分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株SAH301，保藏日期为2014年 9月15日。
[0025] 在本发明的另一个方面，提供了一种杂交瘤，其保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为=CCTCC C2014178,分类命名为： 小鼠杂交瘤细胞株SAH301，保藏日期为2014年9月15日。
[0026] 在本发明的另一个方面，提供了一种组合物，其包含前文所述的单克隆抗体或者 其抗原结合部分。
[0027] 在本发明的另一个方面，提供了一种酶联免疫检测试剂盒，其包含前文所述的抗 体或其抗原结合部分；优选地，所述的试剂盒还含有：20倍浓缩洗涤液、酶标包被板、酶标 抗体稀释液、酶标抗体、样品稀释液、显色液A液、显色液B液、终止液和封板膜。
[0028] 在本发明的另一个方面，提供了一种用于检测样品中SAH水平的快速胶体金检测 试纸，其特征在于所述的试纸包括前文所述的单克隆抗体301或者其抗原结合部分。
[0029] 在本发明的另一个方面，提供了一种检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试剂 盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：（1)前文所述的快速胶体金检测试纸；和（2)使用说 明。
[0030] -种检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或者其水平的非治疗或诊断目的 的方法，其包括使用前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述的组合物、前文所述的 酶联免疫检测试剂盒、前文所述的快速胶体金检测试纸或者前文所述的快速胶体金检测 试剂盒来进行检测；优选地，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进一步优选 地，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。
[0031] 在本发明的另一个方面，提供了前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述 的杂交瘤、前文所述的组合物或者前文所述的快速胶体金检测试纸在制备用于检测生物体 的甲基化指数的试剂盒中的用途，所述的试剂盒用于检测样品中的SAH水平；优选地，所述 的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进一步优选地，所述的血液样品是血清样品或 者血浆样品。
[0032] 在本发明一个优选的方面，所述的试剂盒用于辅助诊断抑郁症、巴金森氏、脑出 血、脑栓塞、脑动脉粥样硬化病和肝炎等。
[0033] 在本发明的另一个方面，提供了前文所述的抗体或者其抗原结合部分、前文所述 的组合物、前文所述的酶联免疫检测试剂盒、前文所述的快速胶体金检测试纸或者前文所 述的快速胶体金检测试剂盒的非治疗或诊断目的的用途，其用于检测S-腺苷同型半胱氨 酸在样品中的存在或其水平；优选地，所述的样品选自血液样品、组织样品和细胞样品；进 一步优选地，所述的血液样品是血清样品或者血浆样品。
[0034] 本发明还提供了以下的技术方案：
[0035] 本发明提供了抗原SAH-BSA的制备方法，具体地为：将5mgSAH、28. 8mgBSA、 14. 96mgEDC· HC1、5. 3mgN羟基丁二酰亚胺和5mL(pH7. 4)PBS缓冲液依次加入反应瓶中，并 在磁力搅拌下反应6个小时。将反应产物装透析袋，对pH7. 4, IOmM的PBS透析24小时，期 间换液2-3次。定量，备用。
[0036] 本发明还提供了杂交瘤和单克隆抗体的制备方法，其包括以下的步骤：以每只小 鼠 IOOug的剂量加弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0. 3ml?0. 6ml，间隔 3周，同样剂量加不完全佐剂乳化，再同样注射一次，以后隔周同样剂量加不完全佐剂乳化， 加强免疫2次，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠，融合前3天用抗原水剂加强，3 天后做融合试验。
[0037] 本发明与现有技术相比，做出了大量的改进和革新，并且得到了有益的技术效果， 例如：
[0038] 1.与勾宏霞等人发表于2005年的论文（中华检验医学杂志，2005年1月，第28 卷第1期，第92-95页）相比：
[0039] 1)2005发表的文章用的分子比是SAH :BSA = 4. 47-4. 9:1，本发明是用的SAH :BSA =35-40:1。除了牛血清白蛋白，还尝试了使用其它载体蛋白，例如多聚赖氨酸和KLH，各种 分子比SAH :载体蛋白=20-600 :1均尝试过，有些融合细胞的上清和腹水的抗SAH抗体的 效价非常高，但是在竞争反应中表现不佳。而最有用的抗体应该是在设计好的竞争性酶联 免疫吸附实验中能够很好的抑制游离SAH小分子抗原，并且抑制程度和所加入的游离SAH 抗原成正相关。我们还尝试了多种来源的SAH作为免疫原。其中包括Sigma-Aldrich的 SAH，国内公司合成的SAH和我们公司定制的SAH钠盐。免疫原的纯度均为98%以上。
[0040] 2)免疫小鼠的过程不同。
[0041] 详见实施例2的方法部分。
[0042] 3)筛选，鉴定单抗细胞的方法不同。
[0043] 文献中提到的竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA)，其标准曲线是同型半胱氨酸，通 过酶学反应将同型半胱氨酸转变成S-腺苷同型半胱氨酸，作为反应产物的S-腺苷同型半 胱氨酸与包被在酶联板上的SAH竞争SAH单克隆抗体。我们的方法是直接使用SAH更稳定 的标准品SAH钠盐和SAH分子直接竞争抗SAH抗体。这样结果稳定性好，SAH的量控制得 准确，不受酶学反应多变性的限制。方法更现实可靠，因而结果就更加更可靠。
[0044] 4)抗体的特性有不同-特异性（交叉反应），亲和力等。
[0045] 我们根据SAH结构，分别设置了鼠抗SAH单克隆抗体（来源于本发明的细胞株， 301或简称301)跟S-腺苷蛋氨酸，腺苷，同型半胱氨酸，半胱氨酸，谷胱甘肽，胱硫醚的交 叉反应。而2005年的文章仅做了 S-腺苷蛋氨酸，腺苷，半胱氨酸和蛋氨酸的交叉反应，其 实蛋氨酸的交叉反应没有必要做，最应该做的是同型半胱氨酸和S-腺苷蛋氨酸，因为这两 个分子在结构上与SAH最接近。为什么2005年那篇文献没有做同型半胱氨酸的交叉反应？ 因此，2005年得到的鼠抗SAH单克隆抗体很有可能跟同型半胱氨酸存在交叉反应的。如果 是与同型半胱氨酸存在交叉反应，那么按照那篇文章的技术路线和得到的最终细胞株未必 是真正意义上的高特异性的抗SAH的单克隆抗体。
[0046] 5)抗SAH单克隆抗体用途不同。
[0047] 2005年文献的目的是测定样品中同型半胱氨酸的含量，将未知样品或者标准品同 型半胱氨酸在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的作用下转变成S-腺苷同型半胱氨酸，用SAH 抗体与该反应的产物S-腺苷同型半胱氨酸特异地结合。但是，如上边4)所述，2005年那株 抗SAH单克隆抗体有可能跟原料同型半胱氨酸有交叉反应，试验设计中没有考虑到没有完 全反应的同型半胱氨酸对结果的影响，也没有实验数据证明反应是否完全。本发明的抗SAH 单克隆抗体就是用来定量SAH含量的。我们采用的是较稳定的SAH钠盐做标准品，摈弃了 酶学反应的不足之处，因为酶学反应容易受其它因素的影响。本发明也有实验数据证明我 们所验证过的三个来源的SAH标准品得到的结果是一致的。
[0048] 6)设计了更为严格的验证试验。
[0049] 在2005年文献（见《中华检验医学杂志》2005年1月第28卷第1期第93页表1) 中，没有计算出其抗体特异性即交叉反应的具体数值，SAM的交叉反应还是可以看出较明显 的竞争抑制，但是交叉反应大于本发明的抗SAH单抗克隆抗体301。该项试验有以下几个问 题：（1)该报道的交叉反应试验设计存在较大的问题，由于细胞培养上清分泌的抗体的量 不可能一样，也不能准确估计其准确的含量，所以很难确定那些竞争性ELISA试验条件足 够准确地得出可靠的结论。因为竞争性ELISA反应中抗体和竞争抗原的相对含量需要在比 较合适的情况下，才能看出竞争性抑制。用上清做竞争交叉得出的结论很不可靠。（2)竞争 性游离抗原应该用跟SAH -样的浓度或高于SAH浓度才能安全地准确地得出与SAH抗体没 有交叉反应的结论，而那个表2的腺苷用的浓度为0. 05mM，SAH为0. ImM，腺苷浓度明显低 于SAH的浓度，结果不能排除该SAH抗体与腺苷存在交叉反应的可能。
[0050] 7)此外，2005年文献中提到的鼠抗SAH单克隆抗体，0D450值很低，充分反映了该 株抗体的亲和力和特异性都不好。
[0051] 以上特异性，亲和力，效价都是反映单抗是否有用的重要指标。我们得到的301单 克隆抗体细胞株在以上各个方面都优于2005年发表文章中提到的鼠抗SAH单克隆抗体。与 此同时，由于本发明的单克隆抗体301的以上特性，可以用于测量生物体内的甲基化指数， 这是2005年论文中的单克隆抗体所无法实现的。
[0052] 2.美国abeam公司有兔抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体出售。与之相比较，本 发明中的鼠抗SAH单抗有如下优越之处：
[0053] 我们的鼠抗SAH单克隆抗体在免疫检测中（如竞争性ELISA)的检测灵敏度明显 高于兔抗SAH单抗的（兔抗SAH单抗的检测下限260nM,我们的鼠抗SAH单抗的检测下限 是15-30nM)。由于正常人血浆中SAH含量很低，这就对检测方法的灵敏度有较高的要求，在 免疫检测中，单克隆抗体的特殊性质是决定检测灵敏度最重要的因素。因而我们可以说我 们的细胞株有其独特的特性。
[0054] 本发明的技术方案还带来了以下的技术进步：
[0055] (1)本发明的单克隆抗体301与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的特异性， 与类似物交叉反应很小，可以忽略不计。具体地参见本发明中的数据部分。
[0056] (2)本发明的单克隆抗体301与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的灵敏度。 具体地，本发明的鼠抗SAH单克隆抗体301对SAH的检测下限是15-30nM，比现有的兔源抗 SAH单克隆抗体的灵敏度高10倍以上，对于低浓度下SAH含量检测有重大意义，否则无法知 道不同样品中SAH到底有多低。尤为重要的是，用LC-MS/MS方法检测正常血浆中SAH含量 在20-80nM，现有兔抗SAH单克隆抗体无法分开正常人和SAH含量低于260nM的病人样品。 这表明，本发明的单克隆抗体301率先使用单克隆抗体法实现了 LC-MS/MS方法的灵敏度， 得到了灵敏度高且特异性强的单克隆抗体和使用该抗体的免疫检测方法，并由此开发了快 速简易的免疫检测产品。
[0057] (3)该细胞株及其产品第一次使得免疫方法检测生命代谢活动过程中甲基化指数 (即S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的比值）成为可能。免疫学方法已经被公认 是非常灵敏，特异，精确，快速，简单而通用的实验技术，能够以较低的花费在临床应用中普 及。因而，本发明中获得的抗SAH单克隆抗体细胞株将有很大的实用性和应用前景。
[0058] (4)直接性竞争酶联免疫吸附试验比间接性竞争酶联免疫吸附试验结果更稳定， 检测灵敏度更高。

【专利附图】

【附图说明】
[0059] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0060] 图1抗SAH鼠单抗301做间接法竞争性酶联免疫吸附试验的结果。S-腺苷同型半 胱氨酸标准品（SAHNa)，S-腺苷蛋氨酸（SAM)，腺苷（Ade)，同型半胱氨酸（H-Cys)，左旋半 胱氨酸（L-Cys)，谷胱甘肽（GST)，胱硫醚（L-CTT)和适当稀释的抗SAH单克隆抗体，孵育 后，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG，孵育后加入TMB底物显色。A为加了竞争抗 原孔在450nm波长下的OD值，AO是零竞争孔在450nm波长下的OD值。
[0061] 图2本发明中的鼠抗SAH单克隆抗体和兔抗SAH单克隆抗体灵敏度比较的图。
[0062] 图3本发明中的抗SAH单克隆抗体301-1与S-腺苷蛋氨酸（SAM，Sigma目录号 A2408,即对苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸）的交叉反应率测定结果。该曲线的纵坐标是LnP，其 中P = (Α/ΑΟ) Λ1-Α/Α0)。横坐标是LogM，其中M是游离SAH竞争物的摩尔浓度。
[0063] 图4abcam的兔抗SAH单克隆抗体与S-腺苷蛋氨酸（SAM)的交叉反应率测定的结 果。该曲线的纵坐标是LnP，其中P = (Α/ΑΟ) Λ1-Α/Α0)。横坐标是LogM，其中M是游离SAH 竞争物的摩尔浓度。
[0064] 图5A，用301抗体在健康乳腺组织中做免疫组织化学结果的图，棕色区域表明在 细胞核和胞浆有SAH强阳性染色；B:用301抗体在乳腺癌组织中做免疫组织化学，胞浆和 细胞核区域显示为SAH阴性（或弱背景染色）；C:用301抗体在健康肾脏组织中做免疫组 织化学，棕色区域表明在细胞核和胞浆有SAH强阳性染色；D:用301抗体在肾癌组织中做 免疫组织化学，胞浆和细胞核区域显示为SAH阴性（或弱背景染色）。
[0065] 图6流式细胞术分析的对照图，其中肝细胞系L02和肝癌细胞系!fepG2做空白染 色，没有加抗SAH抗体。
[0066] 图7肝细胞系L02和肝癌细胞H印G2用抗SAH单克隆抗体（301-1)染色结果比较 图，其中H印G2细胞系染色后的荧光信号比L02细胞系的荧光信号低，表明癌变会导致细胞 内SAH浓度下降。
[0067] 图8A中显示了正常人血清中SAM的含量结果，横坐标是血清SAM含量（nM),纵坐 标是样品例数（总共82例）。
[0068] 图8B中显示了正常人血清中SAH的含量，横坐标是血清SAH含量（nM),纵坐标是 样品例数（总共82例）。
[0069] 图8C中显示了正常人血清甲基化指数，横坐标是血清甲基化指数，纵坐标是样品 例数（总共82例）。
[0070] 图9A中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAM的含量，横坐标是血清SAM含量 (nM)，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0071] 图9B中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清中SAH的含量，横坐标是血清SAH含量 (nM)，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0072] 图9C中显示了抑郁症和巴金森氏病人血清甲基化指数，横坐标是血清甲基化指 数，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0073] 图IOA中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAM的含量，横坐标 是血清SAM含量（nM)，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0074] 图IOB中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清中SAH的含量，横坐标 是血清SAH含量（nM)，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0075] 图IOC中显示了脑出血，脑栓塞，脑动脉粥样硬化病人血清甲基化指数，横坐标是 血清甲基化指数，纵坐标是样品例数（总共20例）。
[0076] 图IlA中显示了正常人血楽中SAM的含量，横坐标是血楽SAM含量（nM),纵坐标 是样品例数（总共310例）。
[0077] 图IlB中显示了正常人血楽中SAH的含量，横坐标是血楽SAH含量（nM),纵坐标 是样品例数（总共310例）。
[0078] 图IlC中显示了正常人血浆甲基化指数，横坐标是血浆甲基化指数，纵坐标是样 品例数（总共310例）。
[0079] 图12A中显示了肝炎病人血浆中SAM的含量，横坐标是血浆SAM含量（nM)，纵坐 标是样品例数（总共24例）。
[0080] 图12B中显示了肝炎病人血浆中SAH的含量，横坐标是血浆SAH含量（nM)，纵坐 标是样品例数（总共24例）。
[0081] 图12C中显示了肝炎病人血浆甲基化指数，横坐标是血浆甲基化指数，纵坐标是 样品例数（总共24例）。
[0082] 图13是胶体金试纸条测定尿液中SAH含量的结果的图，A :是阴性对照（PBS)，B: 尿液用PBS进行100稀释尿液后上样，C:尿液用PBS进行10稀释尿液后上样，D:未经稀释 的尿液上样。

【具体实施方式】
[0083] 实施例1:抗原SAH-BSA的制各
[0084] 本实施例中所使用的化学试剂和材料购买途径如下：
[0085] SAH购自成都诺维生物科技有限公司；BSA，牛血清蛋白，购自SIGMA公司；EDC. HCl 购自SIGMA公司；N羟基丁二酰亚胺购自SIGMA公司；透析袋截留小孔径为8000-12000,购 自北京博奥拓达科技有限公司；以及IOmMPBS磷酸盐缓冲液（pH为7.4)为自行配制。
[0086] 在反应瓶中顺序加入 5mgSAH、28. 8mgBSA、14. 96mgEDC. HC1、5. 3mgN 羟基丁二酰亚 胺和5mL(10mM，pH7. 4)PBS，并在磁力搅拌下反应6个小时。反应物装透析袋对pH7. 4, IOmM 的PBS透析24小时，期间换液3次。透析完毕，确定体积，浓度，分装，冻存备用，从而制备 得到BSA-SAH水剂。
[0087] 实施例2:杂夺瘤和单克降抗体的制各
[0088] 所使用的8周龄雌性BALB/C小鼠，购自中国科学院动物所。
[0089] 所使用的试验试剂：弗氏完全佐剂，购自SIGMA公司；BSA，牛血清蛋白，购自SIGMA 公司；BSA-SAH水剂，按照实施例1制备；RPMI1640液，购自GIBCO公司；PEG4000,购自北京 拜尔迪生物公司；SP2/0骨髓瘤细胞，购自上海研域生物科技有限公司；多聚赖氨酸-SAH偶 联抗原，购自Sigma公司；酶联板，购自北京拜尔迪公司；羊抗鼠-HRP二抗，其购自南京生 兴生物；HAT选择培养液，其购自SIGMA公司；矿物油，购自SIGMA公司；牛血清白蛋白偶联 的SAH，购自Sigma公司。
[0090] 试验仪器：酶标仪MultiskanFC酶标仪，购自热电科学仪器公司。
[0091] 取一组6只8周龄雌性BALB/C小鼠，每只小鼠分多点皮下注射前文所述的接种试 齐U，接种按照表1进行。每次接种〇. 3mL的接种试剂，其中含有BSA-SAH100微克。
[0092] 表1BALB/C小鼠接种抗原SAH-BSA的接种方案
[0093]

【权利要求】
1. 特异性结合s-腺苷同型半胱氨酸的单克隆抗体301或者其抗原结合部分，所述单克 隆抗体由杂交瘤细胞株301产生；并且所述的杂交瘤细胞株301产生保藏在中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCC C2014178,保藏日期为2014年9月15日。
2. -种杂交瘤，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2014178,保藏日 期为2014年9月15日。
3. -种组合物，其包含权利要求1的抗体或者其抗原结合部分。
4. 一种酶联免疫检测试剂盒，其包含权利要求1的抗体或其抗原结合部分。
5. 权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有：20倍浓 缩洗涤液、酶标包被板、酶标抗体稀释液、酶标抗体、样品稀释液、显色液A液、显色液B液、 终止液和封板膜。
6. -种用于检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试纸，其特征在于，所述的试纸包 括权利要求1所述的单克隆抗体301或者其抗原结合部分。
7. -种检测样品中SAH水平的快速胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包 括： (1) 权利要求6所述的快速胶体金检测试纸；和 (2) 使用说明。
8. -种检测S-腺苷同型半胱氨酸在样品中的存在或者其水平的方法，其包括使用权 利要求1所述的抗体或者其抗原结合部分、权利要求3所述的组合物、权利要求4或5所述 的酶联免疫检测试剂盒、权利要求6所述的快速胶体金检测试纸或者权利要求7所述的快 速胶体金检测试剂盒来进行检测。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的样品选自血液样品、组织样品和细 胞样品。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的血液样品是血清样品或者血浆样 品。
11. 权利要求1所述的抗体或者其抗原结合部分、权利要求2所述的杂交瘤、权利要求 3所述的组合物或者权利要求6所述的快速胶体金检测试纸在制备用于检测生物体的甲基 化指数的试剂盒中的用途，所述的试剂盒用于检测样品中的SAH水平。
12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的样品选自血液样品、组织样品和 细胞样品。
13. 根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的血液样品是血清样品或者血浆 样品。
14. 根据权利要求11-13中任一项所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于诊断抑 郁症、巴金森氏、脑出血、脑栓塞、脑动脉粥样硬化病或者肝炎。
15. 权利要求1所述的抗体或者其抗原结合部分、权利要求3所述的组合物、权利要求 4或5所述的酶联免疫检测试剂盒、权利要求6所述的快速胶体金检测试纸或者权利要求 7所述的快速胶体金检测试剂盒的非治疗或诊断目的的用途，其用于检测S-腺苷同型半胱 氨酸在样品中的存在或其水平。
16. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的样品选自血液样品、组织样品和 细胞样品。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的血液样品是血清样品或者血浆 样品。
【文档编号】G01N33/577GK104479022SQ201410570652
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】郝秀娟, 任会明, 肖平, 李惠军, 甘鸿杰, 周雅娴, 夏嘉志, 郝广钧 申请人:湖南天合生物技术有限公司