一种甲基汞离子的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种甲基汞离子的检测方法。该结合纳米材料的优势，利用甲基汞离子对以标记了荧光素的富T碱基DNA为模板的银纳米颗粒形成的阻断，实现荧光的保留，以此来检测甲基汞离子。本发明的甲基汞离子的检测方法方便简单快速，无需昂贵仪器，花费低廉，检测灵敏度高，同时能够在对甲基汞离子实现高响应的同时较好的克服二价汞离子的干扰，具有良好的实际应用前景。
【专利说明】-种甲基汞离子的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米技术和分析检测领域，具体涉及一种甲基汞离子检测方法。
【背景技术】
[0002] 汞是一种具有很强毒性的重金属，并且由于其分布广泛，容易形成各种形态的污 染物。在各种形态的汞化合物中，有机汞，尤其是其中的甲基汞，因其具有很强的脂溶性，易 于穿透血脑屏障，具有比无机汞强很多的中枢神经毒性，此外，由于其性质稳定，难以代谢， 容易在生物体内进行原型蓄积,使其成为了一种备受关注的高毒性物质（《The Toxicology of Mercury and Its Chemical Compounds》，Crit. Rev. Toxicology. 2006,36,609-662)。自 然界中的甲基汞多是在微生物的作用下由无机汞转变而来，并能通过食物链进行富集。历 史上，日本的熊本县水俣湾曾经由于人们误食了含有大量甲基汞的鱼类而出现了严重的运 动，感觉机能萎缩的病症，也就是后来为人所熟知的水俣病。由此可见，甲基汞的检测对环 境和人类的健康都具有非常重要的意义。
[0003] 现有的甲基汞检测手段主要是一些传统的仪器方法，例如：原子吸收光谱，原子荧 光光谱，电感耦合等离子共振质谱等这些传统的金属检测仪器以及与气相色谱，高效液相 色谱等分离手段进行联用，这些方法无一例外地都需要较长的样品前处理步奏，以及昂贵 的仪器花费。
[0004] 荧光分析方法由于其高灵敏度，高选择性，简单快速的优势，在金属离子的检测应 用中得到了广泛的发展，今年来，也出现了一些针对甲基汞设计的有机荧光探针。如：《A chemodosimeter approach to fluorescent sensing and imaging of inorganic and methylmercury species》， Chem Commun，2009,2115-2117,《Fluorescent detection of methylmercury by desulfurization reaction of rhodamine hydrazide derivatives)), Org. Biomol. Chem. 2009,7,4590-4593等。但这些工作都无一例外的存在一个缺陷，不能实 现单一识别甲基汞离子而不对汞离子响应，相反地，由于甲基汞与配体结合较弱，往往二价 汞离子的响应要明显高于甲基汞离子。由此可见，设计一个简单，快速，同时相对于二价汞 离子，对甲基汞离子具有高响应的荧光探针具有重要的意义。
[0005] 银纳米颗粒作为一种的常见贵金属纳米材料，继金纳米颗粒之后，吸引了广泛的 关注。类似于金纳米颗粒，银纳米颗粒在400nm左右具有特征的等离子共振吸收峰，该特征 峰随着纳米颗粒分散性的变化而变化。结合银纳米颗粒所具有更高的消光系数，这使得其 相较于金纳米颗粒而言用于比色检测能够达到更高的灵敏度，而基于银纳米颗粒的比色检 测方法已被应用到DNA，金属离子，蛋白质等目标物的检测当中。同时银纳米颗粒具有拉曼 增强的性质，作为常见的拉曼增强基底而被广泛的应用于设计拉曼信号输出探针。
[0006] 最近，M. Dickson等提出了以DNA为模板合成银纳米团簇的方法，该方法通过 先将一定比列，而正因为粒径较小，产生纳米尺寸效应，具有离散的电子能级，电子容易 被激发因而这一类团簇往往具有较强的荧光，该工作发表在JACS上（《DNA-Templated Ag Nanocluster Formation》，J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 5207-5212)。接下来，该课题 组继续研究发现银纳米簇的荧光是跟模板DNA链的序列密切相关的，通过改变序列，可 以调控发射的波长达到近红外区域（《Oligonucleotide-Stablized Ag Nanocluster Fluorophores》，J. Am. Chem. Soc. 2008,130, 5038-5039)。此后，一系列利用具有荧光的银纳 米簇进行分析检测的工作得到了发表，包括DNA，金属离子，以及单碱基多态性分析等。
[0007] 当增加银离子与DNA的比例时，利用DNA为模板形成的银纳米颗粒不再具有荧光， 而且它们会与DNA相连的荧光基团的荧光将起到较强的猝灭作用。同时，文献中曾经报道 过，DNA序列中的T碱基与甲基萊离子具有的结合常数最强（《Association Constants of Methylmercuric and Mercuric Ions with Nucleosides》，J. Am. Chem. Soc. 1964,86, 2059-2065)，那么，在甲基汞离子存在的情况下，银离子的结合位点被占据，将不能形成以 富含T碱基DNA为模板的银纳米颗粒，标记在DNA上的荧光素的荧光得到保留。此外，由于 二价萊离子能与富含T碱基的DNA序列形成T-Hg2+-T的稳定结构（《Mercuryll-Mediated Formation of Thymine HgII Thymine Base Pairs in DNA Duplexes》，J. Am. Chem. Soc. 2006,86, 2059-2065)，当汞离子存在时，在硼氢化钠的还原下，将会在富含T碱基的 DNA上形成银汞纳米颗粒，同样能起到淬灭荧光素荧光的作用。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种甲基汞离子的检测方法。
[0009] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0010] 所述甲基汞离子的检测方法包括如下步骤：
[0011] (1)在TriS-HNO3缓冲溶液中加入标记了荧光素的DNA溶液，TriS-HNO 3缓冲溶液 与标记了荧光素的DNA溶液的体积比为50?60:1，震荡混匀，得混合液1 ;所述Tris-HNO3缓冲溶液的pH为7. 2?7. 4, Tris-HNO3缓冲溶液中Tris的浓度为10mM/L?20mM/L，所 述标记了荧光素的DNA溶液的浓度为4. 8 ii M/L?5. 2 ii M/L ;
[0012] ⑵向混合液1中加入硝酸银溶液，所述硝酸银溶液与步骤⑴中标记了荧光素的 DNA溶液的体积比为1:0. 9?I. 1，震荡混勻，静置，使银离子与DNA充分作用并吸附到DNA 上，得混合液2 ;所述硝酸银溶液的浓度为0. 8mM/L?I. 2mM/L ;
[0013] (3)向混合液2中加入甲基汞离子溶液，甲基汞离子溶液与步骤⑵所述硝酸银溶 液的体积比为1:1，摇匀，得混合液3 ;
[0014] (4)向混合液3中加入硼氢化钠溶液；所述硼氢化钠溶液的浓度为8mM/L?12mM/ L，硼氢化钠溶液与步骤（2)所述硝酸银溶液的体积比为0. 1?0. 5:1 ;
[0015] (5)于490?600nm的荧光光谱条件下检测混合液3中的荧光素含量。
[0016] 优选地，步骤（3)所述甲基汞离子溶液中甲基汞离子浓度为1. 0 M/L?I. 0mM/L。
[0017] 优选地，所述标记了荧光素的DNA溶液中的DNA为富含T碱基的20?45个碱基 的DNA序列。
[0018] 优选地，所述标记了荧光素的DNA溶液中的DNA为富含T碱基的25个碱基的DNA 序列。
[0019] 优选地，所述标记了荧光素的DNA溶液中的DNA序列为5 ' -FAM-CTTTGTTCTTAAAAA TTGTTCTTTG-3'（SEQ ID NO. 1)。
[0020] 下面结合原理对本发明作进一步说明：
[0021] 在TriS-HNOj^冲溶液中加入标记了的荧光素的富T碱基DNA，向上述溶液中加入 硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA充分作用；向上述溶液中加入硼氢化钠，银离 子在DNA上被还原形成银纳米颗粒,荧光素的荧光被淬灭。若在加入硼氢化钠前向溶液中 加入一定量的甲基汞离子作用一段时间，则银离子会在甲基汞离子的竞争作用下脱离DNA 序列，只形成游离的银纳米颗粒而保留荧光，因此可用于检测甲基汞离子。
[0022] 因此，本发明检测甲基汞离子的方法为：在Tris-HNO3缓冲溶液中加入标记了荧光 素的富T碱基DNA溶液，震荡混匀；然后加入硝酸银溶液，震荡混匀，静置，使银离子与DNA 充分作用，吸附到DNA上；再加入甲基汞离子，摇匀；最后加入硼氢化钠溶液，银离子在甲基 汞离子的竞争下脱离DNA序列形成游离的银纳米颗粒，荧光素的荧光得到保留。测量荧光 素在490nm-600nm的突光，实现甲基萊离子的检测。
[0023] 概括来说，本发明以标记有荧光素的富T碱基DNA为模板的银纳米颗粒的合成过 程为基础，在形成银纳米颗粒之前加入甲基汞离子，甲基汞离子和富T碱基DNA序列结合 能力很强，银离子与DNA的结合位点被占据，使得此时只能形成游离的银纳米颗粒，荧光素 的荧光得到保留，实现甲基汞离子的检测。
[0024] 与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0025] 本发明为一种基于DNA为模板的银纳米颗粒来进行甲基汞离子的检测方法，它不 再依赖于复杂昂贵的仪器，而且与新兴的纳米材料进行了较好的结合，通过DNA序列的选 择，可以实现在对甲基汞离子高响应的同时，对二价汞离子响应较小。同时从结果上看，本 发明具有很好的灵敏度与选择性（见实施例2至6)，且操作方法简单。
[0026] 本发明结合了新型的纳米材料，利用了 DNA模板银纳米颗粒的淬灭特性，以及甲 基汞离子对特定DNA序列的强结合能力，设计了一种高特异性的甲基汞离子的纳米探针， 并且其响应性能远远大于二价汞离子，实现了甲基汞离子探针选择性的一个重大突破。
[0027] 总之，本发明结合纳米材料的优势，利用甲基汞离子对以标记了荧光素的富T碱 基DNA为模板的银纳米颗粒形成的阻断，实现荧光的保留，以此来检测甲基汞离子。本发明 的甲基汞离子的检测方法方便简单快速，无需昂贵仪器，花费低廉，检测灵敏度高，同时能 够在对甲基汞离子实现高响应的同时较好的克服二价汞离子的干扰，具有良好的实际应用 前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为实施例1中制得的以DNA为模板的银纳米颗粒透射电镜图；
[0029] 图2为实施例1中制得的在二价汞离子存在的情况下还原后的透射电镜图；
[0030] 图3为实施例1中制得的在甲基汞离子存在的情况下还原后的透射电镜图。
[0031] 图4为实施例2中在标记了荧光素的富含T碱基DNA序列上形成银纳米颗粒对荧 光素突光的淬灭情况；
[0032] 图5为实施例2中形成游离的银纳米颗粒对同一序列的DNA上荧光素荧光的淬灭 情况。
[0033] 图6为实施例3中采用标记了荧光素的富含T碱基DNA为模板合成银纳米颗粒以 及在二价汞离子和甲基汞离子存在的情况下还原的吸收光谱图；
[0034] 图7为实施例4中采用标记了荧光素的富含T碱基DNA为模板合成银纳米颗粒以 及在二价汞离子和甲基汞离子存在的情况下还原的荧光光谱图；
[0035] 图8为实施例5中利用琼脂糖电泳对本检测方法的响应机理进行考察的电泳成像 图；
[0036] 图9为实施例6中对使用本检测方法进行甲基汞离子检测时对于其他干扰金属离 子的选择性响应考察；
[0037] 图10为实施例7中对使用本检测方法进行甲基汞离子检测时对不同浓度甲基汞 离子的荧光响应曲线。
[0038] 图11为实施例7中对使用本检测方法进行二价汞离子检测时对不同浓度二价汞 离子的荧光响应曲线。
[0039] 图12为实施例7中对使用本检测方法进行甲基汞和二价汞离子检测时的浓度工 作曲线。
【具体实施方式】
[0040] 本发明实施例中所用的 DNA 序列为：5 ' -FAM-CTTTGTTCTTAAAAATTGTTCTTTG-3 '，其 中FAM是标记的荧光素，此段序列是从生工生物工程（上海）有限公司购买得到。
[0041] 实施例1制备以DNA为模板的银纳米颗粒：
[0042] 配制制备银纳米颗粒所需的溶液：将由25个碱基组成的富含T碱基的DNA原液 加水稀释得5 ii M/L的溶液，配制ImM/L的硝酸银（AgNO3)溶液，配制10mM/L的硼氢化钠 (NaBH4)溶液，配制 10mM/L 的 Tris-HNO3 缓冲液（pH = 7. 4)待用；
[0043] 向I. 5mL的离心管内加入490 ii L的Tris-HNO3缓冲溶液（10mM/L);取配制好的 5 ii M/L的DNA溶液5 ii L加入，摇匀；取配制好的ImM/L的硝酸银溶液5 ii L加入，摇匀，放 置10分钟（使得银离子与DNA充分作用）；加入10mM/L的硼氢化钠溶液I y L还原，并剧烈 震荡离心管。由于银离子与DNA上的碱基作用进而吸附到了 DNA上，故形成了以DNA为模 板的银纳米颗粒，另两份平行样中在添加硼氢化钠溶液进行还原前分别再加入5 y L ImM/L 的二价汞离子和甲基汞离子。
[0044] 透射电镜图分析：从图1可以看出，没有甲基汞离子/二价汞离子存在时，形成了 均一，分散，直径在5nm左右的银纳米颗粒，在二价汞离子存在的情况下，由图2,不再有分 散的纳米颗粒，取而代之的是网状而不规则的银汞纳米颗粒聚集体，说明二价汞离子存在 的情况下，大量的银汞纳米颗粒堆积在了 DNA序列上。而当甲基汞离子存在的情况下，由图 3,形成的纳米颗粒分散且大小不均一，这是由于失去了 DNA模板的稳定作用，只能形成游 离的银纳米颗粒，分散度变差。
[0045] 实施例2以DNA为模板形成的银纳米颗粒与游离的银纳米颗粒对荧光素荧光的 淬灭作用：
[0046] 取Tris-HNOj^冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到容积为ImL的荧光池中； 取L标记了荧光素的富含T碱基的DNA溶液（5 iiM/L)加入到荧光池中，摇匀；再在荧光 池中加入10 U L的不同浓度的银离子溶液或10 ii L Tris-HNO3缓冲液，使得银离子的终浓 度分别为 〇, 〇? 05, 0? 2, 0? 5, L 0, 2. 0, 4. 0, 8. 0, 15. 0 ii M，摇匀，放置 10 分钟；最后加入 2 ii L 硼氢化钠溶液（10mM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分，测试并分别记录其 荧光发射光谱，得到加入不同浓度银离子形成的DNA模板银纳米颗粒加入对荧光素的荧光 的淬灭情况。
[0047] 同样地，往容积为ImL的荧光池中加入480 ii L Tris-HNOj^冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4);再取IOii L的不同浓度的银离子溶液或IOii LTris-HNO3缓冲液加入荧光池中，使得 银离子的终浓度分别为〇, 〇. 05, 0. 2, 0. 5, 1. 0, 2. 0, 4. 0, 8. 0, 15. 0 ii M，摇匀，放置10分钟； 加入2 ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)还原,摇晃后放置20分钟,使得反应进行充分；最后加入 5 ii L标记了荧光素的富含T碱基的DNA溶液（5 ii M/L)加入到荧光池中，摇匀，测试并分别 记录其荧光发射光谱，得到不同浓度游离的银纳米颗粒对荧光素标记的DNA荧光的淬灭情 况。
[0048] 荧光谱图分析：从图4的荧光谱图中可以看出，随着银离子浓度的增大，荧光素的 荧光被急剧淬灭，在银离子浓度达到8 ii M时，荧光强度已经能淬灭98%以上，说明以DNA为 模板形成的银纳米颗粒能够对标记的荧光素的荧光产生极强的淬灭作用（此时银纳米颗 粒离荧光素距离较近）；相反地，由图5可知，当银纳米颗粒处于游离状态，未在DNA模板上 形成的时候，即便银离子的浓度达到了 15 y M，荧光素的荧光也只淬灭了不到30% (此时银 纳米颗粒离荧光素较远），基于以上的现象，我们可以得到，当甲基汞离子与模板DNA结合 能力很强时，一旦银纳米颗粒形成后游离在溶液中，将会极大的削弱其对DNA标记的荧光 素的淬灭能力，这也是应用本发明对甲基汞离子检测的一个基础。
[0049] 实施例3考察本检测方法对二价汞离子和甲基汞离子响应机理的紫外-可见吸 收光谱：
[0050] (1)取Tris-HNO3缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容积为ImL的吸收 池中；将5 ii L含标记了荧光素的富含T碱基的DNA溶液（5 ii M/L)加入吸收池中，摇匀，测 试其吸收光谱；
[0051] (2)作三个平行实验组：第一组：向步骤（1)所得的溶液中加入5 UL硝酸银溶液 (ImM/L)后,摇匀静置10分钟,再加入I ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)进行还原,反应20分 钟，测试其吸收光谱；第二组：向步骤（1)所得的溶液加入5 y L硝酸银溶液（lmM/L)后，摇 匀静置10分钟，再加入5 ii L甲基汞离子溶液（lmM/L)，最后加入2 ii L硼氢化钠溶液（IOmM/ L)进行还原，反应20分钟，测试其吸收光谱；第三组：向步骤⑴所得的溶液加入5 UL硝 酸银溶液（lmM/L)后，摇匀静置10分钟，再加入L二价汞离子溶液（lmM/L)，最后加入 2 ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)进行还原,反应20分钟,测试其吸收光谱；
[0052] 吸收谱图分析：由图6, (1)为只有含荧光素标记的富含T碱基DNA的吸收,在 260nM和490nM处有两个明显的吸收峰，分别对应DNA与荧光素的吸收。在（2)中，当DNA 上形成银纳米颗粒的时候，除了（1)中的两个峰以外，在390nM处增加了银纳米颗粒的特征 吸收峰。当甲基汞离子存在时，（3)中与（2)相比银纳米颗粒的吸收峰仍存在，但强度下降， 这个时候形成的是在溶液中的游离的银纳米颗粒。而（4)中，当存在二价汞离子的时候，银 纳米颗粒的特征吸收峰消失了，但在330nM处出现了一个新的吸收峰，根据文献报道，这个 峰是银汞复合纳米颗粒的吸收峰，说明二价汞离子存在情况下，在硼氢化钠还原后不能形 成银纳米颗粒，取而代之形成了银汞纳米颗粒。
[0053] 实施例4本检测方法对二价汞离子和甲基汞离子响应的荧光光谱：
[0054] (1)取Tris-HNO3缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容积为ImL的荧光 池中；将5 ii L含标记了荧光素的富含T碱基的DNA溶液（5 iiM/L)加入荧光池中，摇匀，测 试其突光光谱；
[0055] (2)作三个平行实验组：第一组：向步骤（1)所得的溶液加入5 UL硝酸银溶液 (ImM/L)后，摇匀静置10分钟,再加入I ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)进行还原，反应20分 钟，测试其荧光光谱；第二组：向步骤（1)所得的溶液加入5 UL硝酸银溶液（lmM/L)后，摇 匀静置10分钟，再加入5 ii L甲基汞离子溶液（lmM/L)，最后加入2 ii L硼氢化钠溶液（IOmM/ L)进行还原，反应20分钟，测试其荧光光谱；第三组：向步骤（1)所得的溶液加入5 UL硝 酸银溶液（lmM/L)后，摇匀静置10分钟，再加入5 ii L二价汞离子溶液（lmM/L)，最后加入 2 ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)进行还原,反应20分钟,测试其荧光光谱；
[0056] 荧光光谱分析：由图7的荧光谱图可以看出，单纯的荧光素标记的DNA的荧光峰即 (1)，在518nm左右，强度约为750 ;在（2)中，当形成了 DNA为模板的银纳米颗粒后，荧光素 的荧光强度被急剧淬灭到15左右，淬灭比例超过98% ;存在10 y M的甲基汞离子和二价汞 离子的时候进行还原，荧光强度分别为650和150即（3)和（4)，说明利用本发明进行甲基 汞离子的检测响应信号远远高于二价汞离子。有可能实现在二价汞离子存在的情况下对甲 基萊尚子的1?选择性响应。
[0057] 实施例5利用琼脂糖凝胶电泳对检测机理的考察实验：
[0058] 将富含 T 碱基的的标记了荧光素的 DNA C -FAM-CTTTGITCTTAAAAAITGTTCTTTG- 3')溶液（5 ii M/L)与硝酸银溶液（lmM/L)按1:1的比例混合摇勻，静置10分钟；分别取 Tris-HNO3缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到容积为I. 5mL的离心管中，并编号； 分别在1-5号样品中加入⑴10 y L银离子DNA混合溶液；（2) 5 ii LDNA溶液（5 ii M/L)与 5 y L实施例2中所述游离银纳米颗粒混合液；(3) 10 y L银离子DNA混合溶液+2 y L硼氢 化钠溶液（10mM/L) ; (4) 10 ii L银离子DNA混合溶液+5 ii L二价汞离子溶液（lmM/L) +2 ii L 硼氢化钠溶液（10mM/L) ; (5) 10 ii L银离子DNA混合溶液+5 ii L甲基汞离子离子溶液（lmM/ L)+2ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)。每一步加入均摇晃,混匀，并静置10分钟,待反应充分后， 对1-5号样品同时进行琼脂糖凝胶电泳，并成像。
[0059] 电泳图分析：从图8的琼脂糖凝胶电泳成像图中可以看出，泳道1中DNA和银离子 结合以后与泳道2中DNA在游离的银纳米颗粒存在的情况下泳动的速率差不多，且荧光强 度没有明显变化，说明游离的银纳米颗粒并不能对标记在DNA上的荧光素产生较强的荧光 淬灭作用。泳道3中以DNA为模板形成了银纳米颗粒，此时泳动的速度明显减慢，证明了银 纳米颗粒是在DNA链上形成的，与此同时，荧光强度明显减弱，证明了以DNA为模板形成的 银纳米颗粒对标记在DNA上的荧光素具有很强的荧光淬灭能力。泳道4中显示，当存在二 价汞离子的时候，DNA的泳动速度同样减慢，且荧光依然很弱，说明此时形成的银汞纳米颗 粒是在DNA链上的。泳道5中显示，当存在甲基汞离子的时候，DNA的泳动速度重新变快， 且荧光强度明显增加，说明，此时银纳米颗粒是游离在溶液中的，并且游离的银纳米颗粒无 法对标记在DNA链上的荧光素荧光产生很强的淬灭。依靠凝胶电泳实验的结果，证明了本 发明方法能够实验在二价汞离子存在的情况下，对甲基汞离子实现高选择性响应的机理。
[0060] 实施例6本检测方法对各种金属离子的选择性荧光实验：
[0061] 将含标记了荧光素富含T碱基的DNA溶液（5 ii M/L)与硝酸银溶液（lmM/L)按1:1 的比例混合摇匀，静置10分钟；第一组取Tris缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到 容积为ImL的荧光池中；接着加入10 ii L上述混合溶液摇匀；最后加入2 ii L硼氢化钠溶液 (lOmM/L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分。
[0062] 另一组取Tris缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4) 480 ii L加入到容积为ImL的荧光池 中；接着加入5 ii L DNA溶液（5 ii M/L)摇匀；再加入10 ii L的不同金属离子溶液（lmM/L)， 使得各种金属离子浓度为20 ii M摇匀，放置10分钟；最后加入2 ii L硼氢化钠溶液（IOmM/ L)还原，摇晃后放置20分钟，使得反应进行充分。测试并分别记录两组发射光谱，取的荧 光最大值518nm处的数据记录，并分别作成归一化荧光的棒状图。
[0063] 选择性分析：从图9的荧光强度棒状图中可以看出，当未加入银离子的情况下，各 种金属离子存在时加入硼氢化钠基本不影响荧光素的荧光。当银离子存在时除二价汞离 子和甲基汞离子外，其余金属离子并不会对DNA模板银纳米颗粒的形成产生影响，荧光素 的荧光被基本淬灭（铜离子略有一点干扰），甲基汞离子的响应信号约为汞离子的4倍，说 明了本发明用于检测甲基汞离子的响应远大于二价汞离子。对甲基汞离子具有高选择性响 应，且其他金属离子不会对甲基汞离子的检测形成干扰。
[0064] 实施例7本检测方法对甲基汞离子和二价汞离子响应实验：
[0065] 将含标记了荧光素富含T碱基的DNA溶液（5 ii M/L)与硝酸银溶液（lmM/L)按1:1 的比例混合摇匀，静置10分钟；取Tris-HNO3缓冲溶液（10mM/L，pH = 7. 4)480 ii L加入到 容积为ImL的荧光池中；接着加入10 ii L上述混合溶液摇匀；加入10 ii L的不同浓度的氯化 甲基萊溶液，摇匀，放置10分钟；最后加入2 ii L硼氢化钠溶液（10mM/L)还原,摇晃后放置 20分钟，使得反应进行充分，测试并分别记录其荧光光谱光谱，得到不同浓度甲基汞离子的 加入对荧光的保留情况。
[0066] 对于二价汞离子，实验过程相同，只是将加入的氯化甲基汞溶液替换为硝酸汞溶 液即可。
[0067] 荧光谱图分析：从图10和11的荧光谱图中可以看出，随着甲基汞离子和汞离子浓 度的增大，518nm处荧光峰的强度逐渐增强，结合7-3可知在甲基汞离子浓度为IOnM的时 候，就有比较明显的响应，而汞离子浓度得至少到200nM，才会有明显的响应。继续升高浓 度，甲基汞离子的响应可以达到25 iiM,而当二价汞离子浓度达到12 ii M时，继续增加二价 汞离子，荧光强度基本维持不变，根据图12可以看出，无论是检出限，灵敏度，还是响应的 动态范围，甲基汞离子都明显优于二价汞离子。且同浓度下，甲基汞离子的响应信号明显高 于二价汞离子，实现了对甲基汞离子的高选择性检测，具有能够在二价汞离子存在的情况 下实现甲基汞离子检测的应用前景。
【权利要求】
1. 一种甲基隶离子的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 在Tris-HN〇3缓冲溶液中加入标记了英光素的DNA溶液，Tris-HN〇3缓冲溶液与标 记了英光素的DNA溶液的体积比为50?60:1，震荡混匀，得混合液1 ;所述Tris-HN〇3缓冲 溶液的抑为7. 2?7. 4, Tris-HN〇3缓冲溶液中Tris的浓度为lOmM/L?20mM/L，所述标记 了英光素的DNA溶液的浓度为4. 8 y M/L?5. 2 y M/L ; (2) 向混合液1中加入硝酸银溶液，所述硝酸银溶液与步骤（1)中标记了英光素的DM 溶液的体积比为1:0.9?1. 1，震荡混匀，静置，使银离子与DM充分作用并吸附到DM上， 得混合液2 ;所述硝酸银溶液的浓度为0. 8mM/L?1. 2mM/L ; (3) 向混合液2中加入甲基隶离子溶液，甲基隶离子溶液与步骤（2)所述硝酸银溶液的 体积比为1:1，摇匀，得混合液3 ; (4) 向混合液3中加入测氨化轴溶液；所述测氨化轴溶液的浓度为8mM/L?测 氨化轴溶液与步骤（2)所述硝酸银溶液的体积比为0. 1?0. 5:1 ; (5) 于490?600nm的英光光谱条件下检测混合液3中的英光素含量。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述甲基隶离子溶液中甲基隶离子 浓度为 1. 0 y M/L ?1. OmM/L。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记了英光素的DM溶液中的DM为富 含T碱基的20?45个碱基的DNA序列。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记了英光素的DNA溶液中的DNA为富 含T碱基的25个碱基的DNA序列。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述标记了英光素的DNA溶液中的DNA序列 如SEQ ID NO. 1所示，所述DNA序列的5'端标记有FAM。
【文档编号】G01N21/64GK104345054SQ201410571071
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】杨荣华, 邓立 申请人:湖南大学