基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态β-受体激动剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态β-受体激动剂的方法，包括双三元液相色谱系统，双三元液相色谱系统包括净化柱、分析柱、左泵、右泵、多个管路接口，相邻的管路接口之间设有切换阀门；首先通过双三元液相色谱系统对净化柱正向加载样品、对所述分析柱进行冲洗，然后通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱反冲洗脱目标化合物、对所述分析柱进样。可实现样品的在线净化，无需再经过复杂的人工前处理过程，解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，并避免了人工操作带来的实验误差。
【专利说明】基于在线SPE的快速测定尿液中辆合态P-受体激动剂的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种0 -受体激动剂检测技术，尤其涉及一种基于在线SPE的快速测 定尿液中轭合态受体激动剂的方法。
【背景技术】
[0002] 在线SPE技术是一种新型样品快速前处理技术。它可以通过净化柱对样品在线净 化处理，无需经过复杂的前处理过程即可获得良好的净化效果。并且，将在线SPE技术与双 三元高效液相色谱和串联质谱（HPLC-MS/MS)结合，可以在15分钟内实现样品的在线净化、 富集、化合物分离和最终分析，获得稳定可靠、重现性好的确证分析结果（法律判定标准）。 该方法兼具快速检测技术方便便捷和确证分析技术准确的优点，目前，已经被用于对尿液、 人体/动物血清等生物液体以及水等介质中污染物的快速检测。
[0003] 现有技术一：
[0004] 对0 -受体激动剂常用的检测方法是：样品提取一样品浓缩一净化小柱活 化一样品加载一样品洗脱一溶液置换一上机分析，通过整个流程实现样品分析。 该方法的缺点是前处理复杂，需要消耗大量的人力，同时实验结果受到实验人员操作的影 响。
[0005] 现有技术一的缺点：
[0006] 实验周期长，需要经过复杂的前处理净化过程；结果的平行性受前处理操作的影 响。
[0007] 现有技术二：
[0008] -些快速检测技术，如酶联免疫法、胶体金试纸条法等，可实现对3 _受体激动剂 高通量、快速检测。其原理是利用某些与受体激动剂具有特异性结合的抗体、受体、酶， 借助其对目标化合物的识别能力，通过测定生物分子活化程度，从而间接确定目标化合物 含量。
[0009] 现有技术二的缺点：
[0010] 快速分析方法是半定量方法，不能作为确证分析方法；快速分析方法灵敏度远远 低于我们使用的仪器分析方法（即HPLC/MS/MS方法），有时候因为其检测限较高，不能满足 一些大规模监控工作的需要。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种即快速又准确的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合 态受体激动剂的方法。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0013]本发明的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态e-受体激动剂的方法，包括双 三元液相色谱系统，所述双三元液相色谱系统包括净化柱、分析柱、左泵、右泵、第一管路接 口、第二管路接口、第三管路接口、第四管路接口、第五管路接口、第六管路接口，相邻的管 路接口之间设有切换阀门；
[0014] 首先，在样品经过酶解预处理后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱正 向加载样品、对所述分析柱进行冲洗，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第一管 路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，所述左泵依次通过第五管路 接口、第六管路接口与分析柱连接；
[0015] 然后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱反冲洗脱目标化合物、对所述 分析柱进样，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第三管路接口与废液池连接，所 述右泵依次通过第五管路接口、第四管路接口、净化柱、第一管路接口、第六管路接口与分 析柱连接。
[0016] 由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的基于在线SPE的快 速测定尿液中轭合态3 _受体激动剂的方法，可实现样品的在线净化，无需再经过复杂的 人工前处理过程；解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，将原来需要1天 左右的分析时间减少到在15分钟内即可获得分析结果；解决了 受体激动剂的快速检测 方法无法准确定性定量的问题，该方法得到的结果可以作为确证方法使用；无需人工处理， 因此重现性良好，避免了人工操作带来的实验误差。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例中净化柱正向加载样品、分析柱进行冲洗的状态示意图；
[0018] 图2为本发明实施例中净化柱反冲洗脱目标化合物、分析柱进样的状态示意图。
[0019] 图中：1至6分别指示六个管路接口。
【具体实施方式】
[0020] 下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。
[0021] 本发明的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态受体激动剂的方法，其较佳 的【具体实施方式】是：
[0022] 包括双三元液相色谱系统，所述双三元液相色谱系统包括净化柱、分析柱、左泵、 右泵、第一管路接口、第二管路接口、第三管路接口、第四管路接口、第五管路接口、第六管 路接口，相邻的管路接口之间设有切换阀门；
[0023] 首先，在样品经过酶解预处理后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱正 向加载样品、对所述分析柱进行冲洗，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第一管 路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，所述左泵依次通过第五管路 接口、第六管路接口与分析柱连接；
[0024] 然后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱反冲洗脱目标化合物、对所述 分析柱进样，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第三管路接口与废液池连接，所 述右泵依次通过第五管路接口、第四管路接口、净化柱、第一管路接口、第六管路接口与分 析柱连接。
[0025] 所述净化柱采用美国的TurboflowC18-P柱，所述分析柱采用美国的Eclipse XDB-C18 柱。
[0026] 采用以下方法配置标准溶液系列：
[0027] 准确称取沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗标准品，分别用甲醇溶解配置成 1000 li g/mL单标储备液；
[0028] 用甲醇稀释储备液，混合配制成10 U g/mL混合标准工作液；
[0029] 将所述单标储备液和混合标准工作液用0. 1%甲酸水逐级稀释，配制成 0?l-100ng/mL包括 0? 1、0. 5、1，5、10、50、100ng/mL的 7 点标准系列；
[0030] 标准曲线每日进行分析。测定实际样品时，每隔10次进样，重复测定10ng/mL标 准溶液。
[0031] 采用以下方法配置溶剂：
[0032] 0. 1 %甲酸水：取lmL甲酸，与999mL纯水混合均匀后制成；
[0033] lOmmolpH= 8的醋酸铵溶液：取0? 77g醋酸铵，与990mL纯水混合，加冰醋酸调 解pH到8,再加水稀释至lOOOmL后混匀；
[0034] 2molpH= 5. 2的醋酸铵溶液：取7. 7g醋酸铵，与40mL纯水混合，加冰醋酸调解 pH到5. 2,再加水稀释至50mL后混匀。
[0035] 采用以下方法进行样品前处理：
[0036] 酶解样品前处理方法：取lmL尿液样品，加入1. 95mL2MpH= 5. 2的醋酸铵溶 液，加入50yL0 -葡萄糖醛苷酶或芳基硫酸酯酶，在37°C±0. 3°C下酶解16小时后，过 0. 45ym滤膜转移至进样小瓶中待测。
[0037] 样品首先应经过酶解预处理过程，使尿液中所以轭合态化合物转变成游离态以便 进一步分析，借助酶解方法对样品进行预处理可准确测定轭合态目标化合物。
[0038] 本发明的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态受体激动剂的方法，用 Turboflow柱代替传统的SPE柱（净化柱），使杂质和目标化合物在SPE柱得到分离，杂质 直接进入废液，目标化合物组分在柱内保留。因此，该方法可实现样品的在线净化，无需再 经过复杂的人工前处理过程；解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，将原 来需要2天左右的分析时间减少到在15分钟内即可获得分析结果；解决了 0 -受体激动剂 的快速检测方法无法准确定性定量的问题，该方法得到的结果可以作为确证方法使用；无 需人工处理，因此重现性良好，避免了人工操作带来的实验误差。
[0039] 本申请中，净化柱的选择方面，使用了一种新型净化柱。1997年，Turboflow?柱在 美国申请专利（美国专利号=5919368)，其特点是可根据化合物物理性质和化学性质的差 异对其进行选择性保留。在较高的流速下，大分子在柱内几乎无保留，小分子则可在湍流作 用下进入柱内微小孔径，增加柱内驻留时间。因此，这种净化柱可被用于对大分子和小分子 的分离，从而对小分子进行检测。尿液中含有的无机盐、尿素和尿酸等成分，会对分析造成 干扰，使用Turboflow?柱可过滤这些杂质成分，更利于之后连接的串联质谱进行检测。
[0040] 此外，由于根据受体激动剂共有基团苯环上取代基的差异，可分为苯酚类和 苯胺类化合物，其在动物排泄物中的存在形式不同。苯酚类受体激动剂（如沙丁胺醇 和莱克多巴胺）苯环上羟基可与葡萄糖醛苷或硫酸酯结合，在尿液中主要以轭合物形式存 在；而苯胺类（如克伦特罗）的轭合率则较低。因此，在测定苯酚类受体激动剂时，需 要利用酸、碱或酶进行水解后进行测定。本申请在考察了酶解对尿液中3种受体激动 剂测定结果影响后，最终以选择以酶解法对样品进行预处理。
[0041] 具体实施例：
[0042] 如图1所示，双三元液相色谱系统具有可单独操作的双泵设计，给在线SPE技术提 供了良好支持平台。右泵在SPE柱上正向加载样品的时候，左泵可以对分析柱进行净化冲 洗；
[0043] 如图2所示，样品加载完成后，通过阀门切换，左泵对SPE柱反冲洗脱目标化合物， 从而实现进样。整个实验过程通过优化后，还可以节省在线净化时间。
[0044] 1、使用试剂：
[0045] 甲醇购于J.T.Baker公司；甲酸（HPLC级）购自美国DikmaPure公司；醋 酸铵（HPLC级）购自韩国Duksan公司；沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗购于加拿大 Dr.Ethrenstorfer公司；葡萄糖醒苷酶/芳基硫酸酯酶购于德国Merck公司；超纯水由 Milli-Q系统（Millipore，美国）制得。
[0046] 2、使用仪器和其他耗材：
[0047]UltiMateTM3000DGLC双三兀液相色谱（ThermoFisherScientific)系统搭 载TSQEndura三重四极杆质谱仪（ThermoFisherScientific)，此为HPLC-MS/MS系 统；TurboflowC18_P(60iim，1.0X50mm,ThermoFisherScientific，美国）和Eclipse XDB-C18(5iim，4.6X50mm，Agilent，美国）分别用作在线SPE柱和分析柱。
[0048] 3、标准溶液系列配置：
[0049] 准确称取沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗标准品，分别用甲醇溶解配 置成1000yg/mL单标储备液；用甲醇稀释储备液，混合配制成lOyg/mL混合标 准工作液。然后分别用〇. 1 %甲酸水和尿液逐级稀释，配制成2套0.l-100ng/ mL(0. 1，0. 5, 1，5, 10, 50, 100ng/mL)的7点标准系列。标准曲线系列每日进行分析，以保证 分析的准确性。每隔10次进样，重复测定lOng/mL标准曲线，以确证仪器稳定性。
[0050] 4、溶剂配置方法：
[0051] 0. 1 %甲酸水：取lmL甲酸，与999mL纯水混合均匀后制成；
[0052]lOmmol醋酸铵溶液（pH= 8):取0.77g醋酸铵，与990mL纯水混合，加冰醋酸调解 pH到8,再加水稀释至1000mL后混匀。
[0053] 2mol醋酸铵溶液（pH= 5. 2):取7. 7g醋酸铵，与40mL纯水混合，加冰醋酸调解pH 到5. 2,再加水稀释至50mL后混匀。
[0054] 5、样品前处理：
[0055]酶解样品前处理方法：取lmL尿液样品，加入1. 95mL2M醋酸铵溶液（pH= 5. 2)， 加入50yLP-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在37°C(±0. 3°C)下酶解16小时后，过 0. 45ym滤膜转移至进样小瓶中待测。
[0056]未酶解样品前处理方法：取lmL尿液样品，加入2mL2M醋酸铵溶液（pH= 5. 2)，过 0. 45ym滤膜转移至进样小瓶中待测。
[0057] 6、双三元液相色谱样品处理流程：
[0058] 在线SPE和液相色谱加载和洗脱条件，如双三元左、右泵切换方式、切换时间，流 动相配比、流速等参数如表1中所示，其具体流路见图1、图2。
[0059]表1在线SPE和液相色谱加载和洗脱条件
[0060]
【权利要求】
1. 一种基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态￠-受体激动剂的方法，其特征在于，包 括双三元液相色谱系统，所述双三元液相色谱系统包括净化柱、分析柱、左泵、右泵、第一管 路接口、第二管路接口、第三管路接口、第四管路接口、第五管路接口、第六管路接口，相邻 的管路接口之间设有切换阀门； 首先，在样品经过酶解预处理后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱正向加 载样品、对所述分析柱进行冲洗，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第一管路接 口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，所述左泵依次通过第五管路接口、 第六管路接口与分析柱连接； 然后，通过所述双三元液相色谱系统对所述净化柱反冲洗脱目标化合物、对所述分析 柱进样，该过程中，所述右泵依次通过第二管路接口、第三管路接口与废液池连接，所述右 泵依次通过第五管路接口、第四管路接口、净化柱、第一管路接口、第六管路接口与分析柱 连接。
2. 根据权利要求1所述的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态0 -受体激动剂的 方法，其特征在于，所述净化柱采用美国的Turboflow C18-P柱，所述分析柱采用美国的 Eclipse XDB-C18 柱。
3. 根据权利要求2所述的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态￠-受体激动剂的方 法，其特征在于，采用以下方法配置标准溶液系列： 准确称取沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗标准品，分别用甲醇溶解配置成1000U g/mL 单标储备液； 用甲醇稀释储备液，混合配制成10 ii g/mL混合标准工作液； 将所述单标储备液和混合标准工作液用〇. 1 %甲酸水逐级稀释，配制成〇. l-l〇〇ng/mL 包括 0? 1、0. 5、1，5、10、50、100ng/mL 的 7 点标准系列； 标准曲线每日进行分析，每隔10次进样，重复测定10ng/mL标准溶液。
4. 根据权利要求3所述的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态￠-受体激动剂的方 法，其特征在于，采用以下方法配置溶剂： 0. 1 %甲酸水：取lmL甲酸，与999mL纯水混合均匀后制成； lOmmol pH = 8的醋酸铵溶液：取0. 77g醋酸铵，与990mL纯水混合，加冰醋酸调解pH 到8,再加水稀释至1000mL后混匀； 2mol pH = 5. 2的醋酸铵溶液：取7. 7g醋酸铵，与40mL纯水混合，加冰醋酸调解pH到 5. 2,再加水稀释至50mL后混匀。
5. 根据权利要求4所述的基于在线SPE的快速测定尿液中轭合态0 -受体激动剂的方 法，其特征在于，采用以下方法进行样品前处理： 酶解样品前处理方法：取lmL尿液样品，加入1. 95mL 2M pH = 5. 2的醋酸铵溶液，加入 50 y L 0 -葡萄糖醛苷酶或芳基硫酸酯酶，在37°C ±0. 3°C下酶解16小时后，过0. 45 y m滤 膜转移至进样小瓶中待测。
【文档编号】G01N30/88GK104330512SQ201410589994
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】李晓敏, 苏晓鸥 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所