一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法
【专利摘要】一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，被测物质包括寡聚核苷酸链的互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种不同物质，包括以下步骤：⑴配制溶液：a.Tris-HNO3缓冲溶液；b.氧化石墨烯分散液；⑵将荧光探针预热并缓慢冷却到室温；⑶将不同浓度的标准被测物质与荧光探针溶液混合，室温下孵育；⑷加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，测量荧光发射光谱，根据检测到的荧光信号强度，建立被测物质的标准曲线；⑸将样品溶液代替被测物质进行反应，根据检测的荧光信号强度和对应的标准曲线，得到样品溶液中被测物质含量。本发明优点为：灵敏度高干扰小，选择性好，可达到快速检测互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种不同物质的目的。
【专利说明】一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多功能探针实现多种物质检测的研宄，具体是一种多功能寡聚核苷酸链用于互补链CTBA、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸多种物质的荧光检测方法。
【背景技术】
[0002]氧化石墨烯是一种新型碳纳米材料，其厚度仅为单个碳原子粒径大小，却具有广阔的二维平面，氧化石墨烯骨架碳原子都是以SP2形式杂化，使得氧化石墨烯含有丰富的π电子。有报道发现，氧化石墨烯作为荧光受体对单链DNA末端标记的荧光染料具有超强的荧光猝灭能力。其原理是单链DNA中的核苷酸碱基通过31-31堆积的疏水作用力吸附在氧化石墨烯平面上，有效地拉近了 DNA末端的荧光染料FAM与氧化石墨烯的距离并发生荧光共振能量转移FRET效应，于是染料的荧光被猝灭；而当染料标记的单链DNA与其完全互补的单链DNA形成双链DNA后，外侧裸露的磷酸骨架的亲水性作用力占主导地位，双链DNA连带着FAM脱离氧化石墨烯表面，荧光供体FAM和荧光受体氧化石墨烯之间的距离变远，FRET效应消失。利用这种现象，可成功实现高选择性高灵敏性的检测ssDNA，并能识别单个碱基的差异。
[0003]然而，已报道的研宄都只能实现一条寡聚核苷酸链检测一种靶标物，当需要检测不同的靶标物时，只能通过改变寡聚核苷酸链的序列来实现。
【发明内容】
[0004]基于这种现状，本发明开发了一种可用于多种物质荧光检测的多功能寡聚核苷酸链，即一条寡聚核苷酸链实现互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种不同物质的检测。其检测原理与上述现有技术类似，以末端标记有FAM的单链DNA作为荧光探针，此探针命名为FAM-TBA。当体系中只含有FAM-TBA和氧化石墨烯时，FAM-TBA自由卷曲，吸附于氧化石墨烯表面，FRET效应产生，荧光被猝灭。当加入互补链、凝血酶或Hg2+后，FAM-TBA分别形成双链DNA、G-四链体/凝血酶复合物和“T-Hg2+-T”结构，FAM-TBA脱离氧化石墨烯表面，荧光基团FAM与氧化石墨烯之间的距离被拉远，阻碍了 FRET效应的产生，体系的荧光得到恢复，焚光恢复的强度分别与引入的互补链cTBA、凝血酶和Hg2+的量紧密相关。当体系中引入L-半胱氨酸Cys时，Cys的活性巯基与Hg2+络合，将其从“T_Hg 2+_T”结构中移除，FAM-TBA又恢复自然卷曲状态，迅速被氧化石墨烯表面吸附，FRET效应再次产生，荧光发生猝灭，此时荧光猝灭程度与引入的Cys的量紧密相关，可实现Cys的检测。
[0005]本发明的目的正是针对现有技术中一条寡聚核苷酸链只能实现一个靶标物的检测的问题，而提供一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法。选取的检测对象分别为互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸Cys。众所周知，人类许多疾病与基因的单碱基突变相关，因而单碱基错配的DNA的检测显得尤为重要。而凝血酶，是一种丝氨酸蛋白酶，在伤口处会大量的产生，与血小板结合产生凝血作用，但在病理条件下也会导致血栓形成，因此它的检测对生物医学诊断具有重要的意义。再有，Hg2+对肠、肾和脑具有严重的腐蚀作用，Hg2+和人体中含有硫原子的配合基有很强的亲和力，能引起蛋白质、酶和膜的巯基块结。它在人体消化道内可引起严重发炎症状，通常在数小时内即发生腹部痛性痉挛并伴以恶心、呕吐和血性腹泻等。因此，识别和检测Hg2+具有十分重要的意义。最后，L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基的氨基酸，因此，识别和检测L-半胱氨酸具有十分重要的意义。本发明可通过一种荧光探针，在不同的检测体系和应用领域实现目标分析物的检测。
[0006]本发明的目的是通过以下方式技术方案来实现的:
一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，是对互补链、凝血酶、Hg2+和Cys四种物质的荧光检测，具体包括以下步骤:
1)配制溶液:a、Tris-HNO^l冲溶液；b、氧化石墨烯分散液；
2)将100μΜ的荧光探针溶液热处理，90 -100 °C下加热5_10分钟，缓慢冷却到室温；
3)将不同浓度的互补链、凝血酶、Hg2+和Cys标准溶液分别与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时；
4)在上述溶液中加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200μ?,氧化石墨稀浓度为130 Pg mL—1，荧光探针浓度为0.2 MM，室温下反应半小时；测量溶液的荧光发射光谱，建立溶液的荧光信号强度和互补链、凝血酶、Hg2+和Cys之间的标准曲线；
5)将样品溶液代替标准溶液，进行上述反应，将检测到的溶液的荧光信号强度带入标准曲线，得到样品溶液中互补链、凝血酶、Hg2+和Cys的含量。
[0007]所述的互补链cTBA、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸Cys标准溶液的浓度分别为:0.005, 0.01, 0.04, 0.07, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 和 I μΜ 的 cTBA ;0.01，0.05, 0.1,
0.5，I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15 和 20 μδ mL-1 的凝血酶；0.5，I, 3，5，8，10，20，30 和 50 μΜ 的 Hg2+;10, 9，8，7，6，5，4，3，2，I 和 0.5 μΜ 的 Cys。
[0008]所述的Tris-HNOgl冲溶液成分为:20 mM Tris, 10mMNaNO3, ρΗ=8.0。
[0009]所述的荧光探针序列为5’ FAM-GG TTG GTG TGG TTG G-3’。
[0010]用于荧光测量的仪器为Hitachi F-4600荧光分光光度计。
[0011]所述的荧光光谱测量条件:激发和发射狭缝宽度分别为5.0 nm和10.0nm,电压为700 V，激发波长为480 nm，发射波长扫描范围500-580 nm，样品池为0.60 mL的石英比色皿。
[0012]在本发明中，互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种物质分别检测的方法如下:
(I)互补链的检测，如图1所示。将荧光探针溶液预热处理，90-100 °C下加热5-10分钟，缓慢冷却到室温。将不同浓度的cTBA溶液与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时。加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200 μ?,氧化石墨烯浓度为130Kg mL—1，荧光探针浓度为0.2 μΜ，室温下反应半小时，测量荧光发射光谱。在考察该传感器对cTBA选择性的实验中，基本步骤与检测cTBA的步骤一致，不同的是，用相同浓度的其它寡聚核苷酸链代替cTBA，通过对样品在520 nm处荧光发射强度的检测评判该传感器的特异性。
[0013](2)凝血酶的检测，如图2所示。将荧光探针溶液预热处理，90-100 °C下加热5_10分钟，缓慢冷却到室温。将不同浓度的凝血酶溶液与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时。加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200 μ?,氧化石墨烯浓度为130 μδ mL—1，荧光探针浓度为0.2 μΜ，室温下反应半小时，测量荧光发射光谱。在考察该传感器对凝血酶选择性的实验中，基本步骤与检测凝血酶的步骤一致，不同的是，用相同浓度的其它蛋白质代替凝血酶，通过对样品在520 nm处荧光发射强度的检测评判该传感器的特异性。
[0014](3) Hg2+的检测，如图3所示。将荧光探针溶液预热处理，90-100 °C下加热5-10分钟，缓慢冷却到室温。将不同浓度的Hg2+溶液与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时。加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200 μ?,氧化石墨烯浓度为130Kg mL—1，荧光探针浓度为0.2 μΜ，室温下反应半小时，测量荧光发射光谱。在考察该传感器对Hg2+选择性的实验中，基本步骤与检测Hg2+的步骤一致，不同的是，用相同浓度的其它金属离子代替Hg2+，通过对样品在520 nm处荧光发射强度的检测评判该传感器的特异性。
[0015](4)Cys的检测，如图4所示。对荧光探针溶液预热处理，90-100 °C下加热5_10分钟，缓慢冷却到室温。将Hg2+溶液与荧光探针溶液混合，之后加入不同浓度的Cys溶液，室温下孵育0.5小时，加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使得待测样的最终体积为200 μ?,氧化石墨稀浓度为130 Pg ml/1，荧光探针浓度为0.2 μΜ，Η〖2+为10 μΜ，室温下反应半小时，测量荧光发射光谱。在考察该传感器对Cys选择性的实验中，基本步骤与检测Cys的步骤一致，不同的是，用相同浓度的其它氨基酸代替Cys，通过对样品在520 nm处荧光发射强度的检测评判该传感器的特异性。
[0016]本发明的优点在于:灵敏度高，其它对照样品对被测物质的干扰小，可实现对被测物质的选择性检测，从而达到一条寡聚核苷酸链实现互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种不同物质的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是互补链的浓度和荧光强度关系图及干扰性试验。左图:cTBA (a-1: 0.005，
0.01，0.04, 0.07, 0.1，0.3，0.5，0.7和I μΜ)的荧光发射光谱图；右图:单碱基和双碱基错配的对照试验。
[0018]图2是凝血酶的浓度和荧光强度关系图及干扰性试验。左图:凝血酶(a-p:
0.01, 0.05, 0.1, 0.5, I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15 和 20 Pg mL-1)的荧光发射光谱图；右图:其它蛋白质的对照试验。
[0019]图3是Hg2+的浓度和荧光强度关系图及干扰性试验。左图:Hg2+ (a-1: 0.5，I,3，5，8，10，20，30和50 μΜ)的荧光发射光谱图；右图:其它金属离子的对照试验。
[0020]图4是Cys的浓度和荧光强度关系图及干扰性试验。左图:Cys (a_k: 10，9，8，7，6，5，4，3，2，I和0.5 μΜ)的荧光发射光谱图；右图:其它氨基酸的对照试验。
【具体实施方式】
[0021]本发明通过以下具体实例做进一步描述:
一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，具体包括以下步骤:
1)配制溶液:a、Tris-HNO^l冲溶液；b、氧化石墨烯分散液；
2)将100μΜ的荧光探针溶液热处理，90-100 °C下加热5_10分钟，缓慢冷却到室温；
3)将不同浓度的互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸标准溶液分别与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时；
4)在上述溶液中加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200μ?,氧化石墨烯浓度为130 μg mL—1，荧光探针溶液为0.2 μΜ，室温下反应半小时；
5)测量溶液的荧光发射光谱，建立溶液的荧光信号强度和互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸之间的标准曲线；
6)将未知浓度的四种加标溶液代替标准溶液，进行上述反应，将检测到的溶液的荧光信号强度带入标准曲线，得到加标溶液中互补链cTBA、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸Cys的含量分别为 0.083 μΜ，3.12 μδ πι?Λ 5.27 μΜ 和 4.12 μΜ。
【权利要求】
1.一种多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:是对互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸四种物质的荧光检测，具体包括以下步骤: 1)配制溶液:a、Tris-HNO^l冲溶液；b、氧化石墨烯分散液； 2)将100μΜ的荧光探针溶液热处理，90 -100 °C下加热5_10分钟，缓慢冷却到室温； 3)将不同浓度的互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸标准溶液分别与荧光探针溶液混合，室温下孵育半小时； 4)在上述溶液中加入氧化石墨烯分散液和缓冲溶液，使待测样的最终体积为200μ?,氧化石墨稀浓度为130 Pg mL—1，荧光探针浓度为0.2 MM，室温下反应半小时；测量溶液的荧光发射光谱，建立溶液的荧光信号强度和互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸之间的标准曲线； 5)将样品溶液代替标准溶液，进行上述反应，将检测到的溶液的荧光信号强度带入标准曲线，得到样品溶液中互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:所述的互补链、凝血酶、Hg2+和L-半胱氨酸标准溶液的浓度分别为:0.005, 0.01，0.04, 0.07, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 和 I μΜ 的互补链；0.01，0.05, 0.1, 0.5, I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15 和 20 Pg mL-1 的凝血酶；0.5，I, 3，5，8，10，20，30 和 50μΜ 的 Hg2+;10，9，8，7，6，5，4，3，2，I 和 0.5 μΜ 的 L-半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:所述的 Tris-HNOgl冲溶液成分为:20 mM Tris, 100 mM NaNO3, pH=8.0。
4.根据权利要求1所述的多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:所述的荧光探针序列为5’ FAM-GG TTG GTG TGG TTG G-3’。
5.根据权利要求1所述的多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:用于荧光测量的仪器为Hitachi F-4600荧光分光光度计。
6.根据权利要求1所述的多功能寡聚核苷酸链用于多种物质的荧光检测方法，其特征在于:所述的荧光光谱测量条件:激发和发射狭缝宽度分别为5.0 nm和10.0 nm，电压为.700 V，激发波长为480 nm，发射波长扫描范围500-580 nm，样品池为0.60 mL的石英比色皿。
【文档编号】G01N21/64GK104458682SQ201410613314
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】陈霞, 周会娜, 陈千思, 翟妞, 刘萍萍, 金立锋, 郑庆霞, 王晨, 武明珠, 林福呈 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院