基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法
【专利摘要】本发明公开一种 基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法,其 涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的过氧化氢酶测定方法，其特征是利用Fe2+催化H2O2产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，而过氧化氢酶可催化H2O2分解生成H2O和O2，抑制金纳米团簇荧光的猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于过氧化氢酶的检测。在0.01~0.3U/mL范围内荧光强度变化值ΔF650与过氧化氢酶浓度呈线性关系，检测限为0.002U/mL。本发明灵敏度高，重现性好，可用于食品、工业、环境及生命体系中过氧化氢酶的测定。
【专利说明】基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的过氧化氢酶 的测定方法，属于分析化学及纳米【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 过氧化氢酶(又名触酶)，是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶。过氧化氢 酶是一种四聚体血晶素酶，由四个相同四面体排列的亚基组成，每一个亚基都是60000g/ mol，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团，分子量在240000左右。生物体内的活性氧 和自由基的积累，会导致膜脂过氧化，从而引起生物体本身代谢的紊乱。多酶促反应和非酶 促反应都能产生过氧化氢（H202)，H202是有毒害作用的活性氧的前体。过氧化氢酶的主要功 能是催化H202分解为水和氧气，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H202的毒害，同 时该酶对羟自由基具有清除作用。为此，国内外已相继建立了一些测定过氧化氢酶活性的 方法，如紫外分光光度法，滴定法，氧电极法，极谱法和光电比色法等。对于这些方法，有的 需要贵重的仪器，有的需要特殊试剂，有的操作复杂，有的方法其本身就重复性差，精度不 够。因此，建立新的过氧化氢酶活性的测定方法十分有必要。
[0003] 金纳米团簇（goldnanoclusters,AuNCs)作为一种新型的突光纳米材料，其具 有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易 于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催 化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。
[0004] 本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简 便、灵敏的过氧化氢酶检测的新方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针 的过氧化氢酶的测定方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的基于金纳米团簇探 针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是利用Fe2+催化H202产生羟自由基使金纳米团簇的 荧光发生猝灭，而过氧化氢酶能催化H202分解生成H20和02，抑制金纳米团簇荧光的猝灭， 从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于过氧化氢酶的检测。
[0007] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还 原氯金酸的方法制备：将浓度为〇. 02~0. 18mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为 0. 1~0. 8mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 01~0. 1g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于 2(T70°C水浴恒温反应(T3. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液 进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
[0008] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨酸 还原氯金酸的方法制备：将浓度为〇. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0. 5 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 02g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37°C水浴恒 温反应2. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理， 得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
[0009] 本发明利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650nm处的荧光强度值 (F65CI)以判断过氧化氢酶含量，所使用的激发波长为355nm。
[0010] 本发明所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，包括如下步骤： 1)将含不同浓度的过氧化氢酶溶液，所述过氧化氢酶溶液中含有浓度为20mmol/L、pH=7. 4 的HEPES，加入过氧化氢溶液中，所述过氧化氢溶液中含有浓度为20mmol/L、pH=7. 4的 HEPES，然后置于25°C温浴反应15?150分钟；2)将含有浓度为40mmol/L硫酸的Fe2+溶 液与金纳米团簇溶液依次加入步骤1)的反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应1~15分 钟，反应结束后，测定在650nm处的荧光强度值（F65CI)，随着过氧化氢酶浓度的增大，F65(l逐 渐增大，在0.01、. 3U/mL范围内荧光强度变化值A匕5(|与过氧化氢酶浓度呈线性关系，检 测限为 〇. 002U/mL。
[0011] 上述步骤1)所使用的过氧化氢溶液的浓度为1〇ymol/L,反应时间为90分钟； 步骤2)所使用的Fe2+溶液的终浓度为100ymol/L，反应时间为10分钟。
[0012] 所述过氧化氢酶溶液，过氧化氢溶液，Fe2+溶液，金纳米团簇溶液按体积比1 :7 :2 : 8混合，反应总体积为0. 45mL。
[0013] 本发明所述的基于金纳米团簇探针测定人唾液中过氧化氢酶的方法，其特征是包 括如下步骤：1)取新鲜人唾液，经6000转/分钟离心10分钟后，用pH=7. 4的缓冲液稀释， 取0. 025mL稀释液加入到0. 175毫升浓度为10ymol/L的H202溶液中，置于25°C反应 90分钟；2)将0. 05毫升浓度为0. 9mmol/L的含有40mmol/L硫酸的Fe2+溶液与0. 2毫 升金纳米团簇溶液依次加入上述步骤1)的反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分 钟，测定荧光强度值F65(l，通过标准曲线进行定量，获得唾液中的过氧化氢酶含量。
[0014] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还 原氯金酸的方法制备：将浓度为〇. 02~0. 18mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为 0. 1~0. 8mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 01~0. 1g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于 2(T70°C水浴恒温反应(T3. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液 进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
[0015] 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨 酸还原氯金酸的方法制备：将0. 6mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4mL浓度为 0. 02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混 匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分 子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱 避光保存。
[0016] 具体地说，本发明采用的技术方案为： (一）金纳米团簇荧光材料的制备 以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米 团簇荧光材料的制备方法如下：将0. 6mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4mL浓 度为0. 02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液 中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2. 5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后 用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于 4°C冰箱避光保存。
[0017](二）过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶的测定分两步进行：（1) 0. 025毫升样品溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4) 加入0.175毫升浓度为10iimol/L的过氧化氢溶液中，置于25°C反应90分钟；（2)将 0.05毫升浓度为0.9mmol/L的亚铁离子（Fe2+)溶液(含40mmol/L硫酸）与0.2毫升步骤 (一）制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分 钟。反应结束后，以355nm为激发波长，测定在650nm处的荧光强度值（F65Q)，通过匕5。标 准曲线进行过氧化氢酶的测定。
[0018] 本发明的优点： (1)本发明基于Fe2+催化H202产生羟自由基（Fenton反应）使金纳米团簇的荧光发生 猝灭，而过氧化氢酶可催化H202分解生成H20和02，抑制金纳米团簇荧光的猝灭，从而表现 出荧光发射光谱特征的变化，可以用于过氧化氢酶的检测。
[0019] (2)本发明使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇材料其制备过程快速、 简便，不需要任何前修饰步骤。
[0020] (3)本发明所构建的方法测定特异性好、灵敏度高，检测限为0.002U/mL。
[0021] (4)本发明所构建的方法无需复杂的样品前处理过程即可实现人唾液过氧化氢酶 的测定。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观对照图。图中：（A)金纳米团簇溶液 + 10iimol/LH202 + 100iimol/LFe2+;(B)金纳米团簇溶液 + 10iimol/LH202 + 100 ymol/LFe2++ 0.5U/mL过氧化氢酶。
[0023] 图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：（A)金纳米团簇溶液+ 10mol/ LH202 + 100iimol/LFe2+;(B)金纳米团簇溶液 + 10iimol/LH202 + 100iimol/LFe2+ + 0. 5U/mL过氧化氢酶。
[0024] 图3为过氧化氢酶催化体系反应时间对金纳米团簇溶液荧光强度的影响图。
[0025] 图4为不同干扰物质对金纳米团簇溶液荧光强度的影响图。（图中黑柱：干扰物+ 金纳米团簇溶液+ 10 umol/L H202 + 100 iimol/L Fe2+;白柱：干扰物+过氧化氢酶+ 金纳米团簇溶液 + 10 ymol/L H202 + 100 umol/L Fe2+)。
[0026] 图5为金纳米团簇溶液的荧光强度变化值（AF65(l)与过氧化氢酶浓度之间的线性 关系图。
【具体实施方式】
[0027] 本发明所述的HEPES指N-(2_羟乙基）哌嗪-N' -2-乙烷磺酸。本发明实例所用 的Fe2+溶液为任一现有技术公开的Fe2+溶液，其优选为氯化亚铁溶于40mM硫酸配制而成 的Fe2+溶液。
[0028]实例1 : 将0. 6mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4mL浓度为0. 02g/L的氯金酸溶 液加入到4mL浓度为0. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温 水浴槽中反应2.5h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。 所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处 保存，能保持至少一个月的相对稳定。
[0029]实例 2 : 0.025毫升浓度为0. 5U/mL的过氧化氢酶溶液(含HEPES--N_(2_羟乙基）哌 嗪-N' -2-乙烷磺酸，浓度20mmol/L、pH=7. 4)加入0. 175毫升浓度为10iimol/L的过氧 化氢溶液(含ffiPES，浓度20mmol/L、pH=7.4)中，置于25°C反应90分钟。将0.05毫升 浓度为〇. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇 溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟。在紫外灯下观察，不 加入过氧化氢酶的金纳米团簇溶液经Fenton反应之后红色荧光发生猝灭（图1中的A)，而 加入过氧化氢酶反应之后金纳米团簇溶液恢复红色荧光（图1中的B)。图2为不加入过氧 化氢酶的金纳米团簇溶液（图2中的A)和加入过氧化氢酶的金纳米团簇溶液（图2中的B) 经Fenton反应之后的荧光发射光谱图。
[0030]实例 3 : 0.025毫升浓度为0.5U/mL的过氧化氢酶溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0.175 毫升浓度为1〇11111〇1/1的过氧化氢溶液（册?￡5,20臟〇1/1口11=7.4)中，置于25°(：反应 15?130分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0.2毫 升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10 分钟。如图3所示，过氧化氢酶催化反应90分钟后，荧光强度值F65(l变化基本达到平稳，故 选择过氧化氢酶催化反应时间为90分钟。
[0031]实例 4: 干扰实验：〇. 025毫升含不同干扰物质的溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0. 175 毫升浓度为1〇11111〇1/1的过氧化氢溶液（册?￡5,20臟〇1/1口11=7.4)中，置于25°(：反应 90分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0.2毫升实 例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分 钟，测定荧光强度值F65(l。如图4可知，本发明所构建的方法抗干扰能力强。（(T17分别为 空白、氯化钙、硫酸锌、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化镁、葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酐、尿 素、乙酰胆碱、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸转移酶、脲酶、羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶，其中过 氧化氢酶、S-腺苷甲硫氨酸转移酶、脲酶、羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的浓度为0. 5U/mL，其 它的干扰物质的浓度为100Umol/L) 实例5 : 0.025毫升含不同浓度的过氧化氢酶溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0.175毫升 浓度为10以111〇1/1的过氧化氢溶液（冊?￡5,20臟〇1/1口11=7.4)中，置于25°(：反应90分 钟。将0. 05毫升浓度为0. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸)与0. 2毫升实例1制 备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定 荧光强度值F65(l。如图5所示，随着过氧化氢酶浓度的增大，荧光强度变化值AF65(I逐渐增 大，在0.01、. 3U/mL范围内A?65(|与过氧化氢酶浓度呈线性关系，检测限为0.002U/mL。
[0032]实例6 : 0. 025毫升浓度为0. 05U/mL过氧化氢酶溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0. 175 毫升浓度为1〇11111〇1/1的过氧化氢溶液（册?￡5,20臟〇1/1口11=7.4)中，置于25°(：反应 90分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0.2毫升实 例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分 钟，测定荧光强度值F65(l。重复上述步骤12次，得相对标准偏差（RSD)为2. 7%，表明本方法 重现性良好。
[0033]实例7 : 取新鲜人唾液，用6000转/分钟离心10分钟，取上清液用pH=7. 4的HEPES缓冲液（20mmol/L)稀释10倍，取0.025mL稀释液加入到0.175毫升浓度为25iimol/L的过氧化氢溶 液中，置于25°C反应90分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L 硫酸)与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C 水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65(l。通过标准曲线进行定量，获得唾液中的过氧化氢 酶含量。与标准方法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与紫外法无显著性 差异(表1 )。
[0034]表1
【权利要求】
1. 一种基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是利用Fe2+催化H 202产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，而过氧化氢酶能催化H202分解生成H 20和02， 抑制金纳米团簇荧光的猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于过氧化氢酶的 检测。
2. 根据权利要求1所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是 所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的 方法制备：将浓度为0.02、. 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0? f〇.8 mol/ L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 01~0. 1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于2(T70° C水浴 恒温反应(T3. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处 理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
3. 根据权利要求1或2所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特 征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原 氯金酸的方法制备：将浓度为〇. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0. 5 mol/ L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 02 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37° C水浴恒温反 应2. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到 N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特 征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的荧光强度值（F65CI)以判断 过氧化氢酶含量，所使用的激发波长为355 nm。
5. -种基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，包括如下步骤：1)将含不同 浓度的过氧化氢酶溶液，所述过氧化氢酶溶液中含有浓度为20 mmol/L、pH=7. 4的HEPES， 加入过氧化氢溶液中，所述过氧化氢溶液中含有浓度为20 mmol/L、pH=7. 4的HEPES，然后 置于25° C温浴反应15?150分钟；2)将含有浓度为40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液与金纳米 团簇溶液依次加入步骤1)的反应液中，摇匀后置于25° C水浴锅反应1~15分钟，反应结 束后，测定在650 nm处的荧光强度值（F65CI)，随着过氧化氢酶浓度的增大，F65(l逐渐增大， 在0.01、. 3 U/mL范围内荧光强度变化值A^5(|与过氧化氢酶浓度呈线性关系，检测限为 0?002 U/mL。
6. 根据权利要求5所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是 步骤1)所使用的过氧化氢溶液的浓度为10 y mol/L，反应时间为90分钟；步骤2)所使用 的Fe2+溶液的终浓度为100 y mol/L，反应时间为10分钟。
7. 根据权利要求5或6所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特 征是过氧化氢酶溶液，过氧化氢溶液，Fe2+溶液，金纳米团簇溶液按体积比1 :7 :2 :8混合， 反应总体积为〇. 45 mL。
8. -种基于金纳米团簇探针测定人唾液中过氧化氢酶的方法，其特征是包括如下步 骤：1)取新鲜人唾液，经6000转/分钟离心10分钟后，用pH=7. 4的缓冲液稀释，取0. 025 mL稀释液加入到0.175毫升浓度为10 y mol/L的H202溶液中，置于25° C反应90分钟； 2)将0. 05毫升浓度为0. 9 mmol/L的含有40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液与0. 2毫升金纳米 团簇溶液依次加入上述步骤1)的反应液中，摇匀后置于25° C水浴锅反应10分钟，测定荧 光强度值F65(l，通过标准曲线进行定量，获得唾液中的过氧化氢酶含量。
9. 根据权利要求5或8所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特 征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金 酸的方法制备：将浓度为0. 02、. 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0. f 0. 8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0. 01~0. 1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于2(T70° C 水浴恒温反应〇~3. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯 化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
10. 根据权利要求9所述的基于金纳米团簇探针测定人唾液中过氧化氢酶的方法，其 特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨酸还 原氯金酸的方法制备：将〇. 6 mL浓度为0. 5 mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4 mL浓度为0. 02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0. 08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置 于37° C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为 3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4° C冰箱避光保 存。
【文档编号】G01N21/64GK104330392SQ201410614752
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】陈伟, 邓豪华, 彭花萍, 兰青, 刘爱林 申请人:福建医科大学