一种粘虫幼虫围食膜的制样方法
【专利摘要】本发明涉及一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将粘虫幼虫置于盛有石腊的培养皿中，用昆虫针分别从头部和腹部末端固定粘虫幼虫虫体，使其腹面朝上；(2)沿粘虫幼虫的腹中线剖开，取出围食膜，清洗除去围食膜中的内容物；(3)将围食膜置于木制圆片表面，用针尖沿围食膜外周将围食膜固定在木制圆片上；(4)将固定好的围食膜样品放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中浸泡；取出后经冲洗、脱水、置换、干燥后，在真空喷镀仪内喷镀金属膜，即获粘虫幼虫围食膜样品，本发明能较好地解决制作昆虫围食膜电镜样品时难以获得围食膜舒展观察面而严重影响观察效果的问题，可获得高质量的粘虫幼虫围食膜样品，具有方法简单、经济实用的特点。
【专利说明】—种粘虫幼虫围食膜的制样方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，属昆虫的生物防治应用【技术领域】。【背景技术】:
[0002]围食膜(Peritrophic membrane)是昆虫中肠细胞分泌的一层厚薄均勻的长管状薄膜，由中肠前端一直延伸至后肠内。围食膜的主要功能之一是作为中肠上皮细胞和食物之间的有效屏障，保护中肠上皮细胞免受摄取的粗糙食物颗粒的机械损伤及病毒、细菌等病原微生物的入侵。如果围食膜被破坏就会丧失其屏障功能，容易引起病原生物的感染。
[0003]粘虫Mythimna separata (Walker)是一种杂食性重要农业害虫,其寄主包括麦类、玉米、谷子、高粱、水稻等多种禾本科作物，为害严重，损失巨大。随着城乡人民生活水平的提高，对食品的需求正在从热量型向营养型转变，同时人们对绿色食品的需求也与日俱增。目前，防治粘虫的主要方法仍是化学防治，但是化学防治中的有些化学农药与绿色农业的观念相违背，同时化学农药的大量施用所造成的“3R”问题，以及对粮食作物产生的药害等现象屡见不鲜，因此粘虫的无公害防治方法的研发势在必行。
[0004]昆虫的生物防治在害虫无害化治理过程中的地位十分重要，生物防治方法主要包括有天敌昆虫与有益微生物的利用，而有益微生物的利用开发应用较普遍，其中市场广泛使用的有苏云金杆菌Bt、核型多角体病毒(Pseudaletia Nuclear Polyhedrosis Virus,PsNVP)等。然而这些微生物杀虫剂进入昆虫的消化道内所面临的第一道屏障就是围食膜，由于围食膜的作用，导致类似微生物杀虫剂存在毒力较低，杀虫效果表现缓慢的缺点，使得大田应用受到限制。因此寻找有效的增效途径就显得十分重要。
[0005]破坏围食膜的完整性使其产生空隙和孔洞是很多微生物杀虫剂寻找有效增效剂的重要指标。由于昆虫围食膜膜内表面形态结构肉眼很难观察，研究不同增效剂对昆虫围食膜形态结构的影响就必须在电镜下进行观察，进而确定其作为增效剂的潜力。但是，昆虫的围食膜十分薄，很难在电镜下处于舒展状态，稍不留意其组织就遭到破坏，因此，获得一张高质量的围食膜照片并非易事，如果没有一套完整有效的扫描电镜的制样方法很难拍出理想的围食膜电镜照片，致使后续增效剂的筛选实验无法进行实施。鉴于此，研究一套简便有效的粘虫幼虫围食膜的扫描电镜制样方法就具有十分重要的意义。
【发明内容】
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[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，能较好地解决制作昆虫围食膜电镜样品时难以获得围食膜舒展观察面而严重影响观察效果的问题，可获得高质量的粘虫幼虫围食膜样品，具有方法简单、经济实用的特点。
[0007]本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。
[0008]本发明所提供的一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，包括如下步骤:
[0009]1、将粘虫幼虫置于盛有石腊的培养皿中，用3号昆虫针分别从头部和腹部末端固定粘虫幼虫虫体，使其腹面朝上；培养皿为6.5X1.5cm，石腊占其容积的4/5 ；
[0010]2、用医用刀沿粘虫幼虫的腹中线剖开，取出围食膜置于清水中，清洗除去围食膜中的内容物；
[0011]3、将清洗后的围食膜置于木制圆片表面，截取O号昆虫针的针尖部分，用针尖沿围食膜外周将围食膜固定在木制圆片上；木制圆片直径为0.8cm，厚度为1mm，经无水乙醇浸泡15 — 20天；截取O号昆虫针的针尖部分的长度为3mm ；
[0012]4、将固定好的围食膜样品放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中浸泡12 - 16小时；取出后用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10分钟；然后用30%、50%、75%、80%、90%、95%丙酮脱水各一次，每次10分钟；100%的酒精脱水2次，每次20分钟；乙酸异戊酯置换两次，每次20分钟；C02临界点干燥后轻轻拨掉针尖，在真空喷镀仪内喷镀10-20nm的金属膜，即获粘虫幼虫围食膜样品，将围食膜样品置于电子显微镜下观察围食膜表面形态结构并照相。
[0013]本发明与现有的技术相比，能较好地解决制作昆虫围食膜电镜样品时难以获得围食膜舒展观察面而严重影响观察效果的问题，可获得高质量的粘虫幼虫围食膜样品，具有方法简单、经济实用的特点。
【专利附图】
【附图说明】
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[0014]图1为正常粘虫幼虫的围食膜的扫描电镜照片图。
[0015]图2为经人为破坏处理后的粘虫幼虫的围食膜的扫描电镜照片图。
[0016]图3为经人为破坏处理后的粘虫幼虫的围食膜的扫描电镜照片图。
【具体实施方式】
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[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0018]实施例1
[0019]实施本发明，可按以下步骤进行:
[0020]1、首先，将粘虫幼虫置于盛有石腊的培养皿(6.5X1.5cm)中，石腊约占培养皿容积的4/5 ;用3号昆虫针分别从头部和腹部末端固定粘虫幼虫虫体，使其腹面朝上；
[0021]2、用医用刀(长度为12.5cm)沿粘虫幼虫的腹中线剖开，取出围食膜置于清水中，清洗除去围食膜中的内容物，备用；
[0022]3、将清洗后的围食膜轻轻置于经无水乙醇浸15天以上的木制圆片表面(厚度Imm,直径0.8cm)，然后截取3mm长的O号昆虫针的针尖部分，用针尖沿围食膜外周将围食膜轻轻固定在木制圆片上；木制圆片在浸泡过程中至少要更换5次无水乙醇；木制圆片所用的木材取自于使用3年以上的旧木制家具的构件，应选择密度大且切面光滑的木材；
[0023]4、将固定好的围食膜样品放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中浸泡过夜；次日取出后用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10分钟；然后用30 %、50 %、75 %、80 %、90 %、95 %丙酮脱水各一次，每次10分钟；100%的酒精脱水2次，每次20分钟；乙酸异戊酯置换两次，每次20分钟；C02临界点干燥后轻轻拨掉针尖,在真空喷镀仪内喷镀10-20nm的金属膜，即获粘虫幼虫围食膜样品，最后，将围食膜样品置于电子显微镜下观察围食膜表面形态结构并照相。
[0024]实施例2
[0025]电镜照片效果鉴定
[0026]从图1中可以清楚看到，正常粘虫幼虫的围食膜表面光滑，结构致密，没有孔洞和缝隙。
[0027]从图2和图3中可以看出，经过人为破坏处理后的围食膜，其表面变得粗糙，结构不紧密，出现了一些凹沟和细缝。
[0028]由此表明，通过本发明的制样方法，所拍得的围食膜的扫描电镜照片均舒展清晰，并能观察到处理后的围食膜膜内表面形态结构的改变，因此，该方法能够用于粘虫围食膜表面形态结构的观察研究以及微生物杀虫剂的增效剂的筛选过程。
【权利要求】
1.一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，其特征在于包括如下步骤: (1)、将粘虫幼虫置于盛有石腊的培养皿中，用3号昆虫针分别从头部和腹部末端固定粘虫幼虫虫体，使其腹面朝上； (2)、用医用刀沿粘虫幼虫的腹中线剖开，取出围食膜置于清水中，清洗除去围食膜中的内容物； (3)、将清洗后的围食膜置于木制圆片表面，截取O号昆虫针的针尖部分，用针尖沿围食膜外周将围食膜固定在木制圆片上； (4)、将固定好的围食膜样品放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中浸泡12- 16小时；取出后用磷酸缓冲液冲洗3次，每次10分钟；然后用30%、50%、75%、80%、90%、95%丙酮脱水各一次，每次10分钟；100%的酒精脱水2次，每次20分钟；乙酸异戊酯置换两次，每次20分钟；C02临界点干燥后轻轻拨掉针尖，在真空喷镀仪内喷镀10-20nm的金属膜，即获粘虫幼虫围食膜样品，将围食膜样品置于电子显微镜下观察围食膜表面形态结构并照相。
2.根据权利要求1所述的一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，其特征在于培养皿为6.5 X 1.5cm,石腊占其容积的4/5。
3.根据权利要求2所述的一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，其特征在于木制圆片直径为0.8cm,厚度为Imm,经无水乙醇浸泡15 — 20天。
4.根据权利要求3所述的一种粘虫幼虫围食膜的制样方法，其特征在于截取O号昆虫针的针尖部分的长度为3mm。
【文档编号】G01N1/28GK104406829SQ201410618025
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】张国辉 申请人:长江大学