一种游离的中链脂肪酸的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和混合脂肪酸标样分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可；所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或固体乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠；当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括外标溶液和内标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液；所述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种。该方法操作简单、准确度高、精密度高和萃取效率高。
【专利说明】一种游离的中链脂肋酸的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种游离的中链脂肪酸的测定方法。
【背景技术】
[0002]原料乳和乳制品中的游离脂肪酸对其品质产生重要影响，尤其对乳制品风味的作 用影响最大。游离脂肪酸作为乳及乳制品的风味物质及风味物质前体，一部分来自于原料 固有成分，比如原料乳中的乳脂肪即三甘油酯混合物，就是由长链脂肪酸和中短链脂肪酸 构成。还有一部分游离脂肪酸可能是在加工制造过程中产生，比如千酪的成熟过程中，乳脂 肪会在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，赋予干酪强烈的特征性风味；在被嗜冷菌污染的 液态乳（特别是货架保质期较长的超高温灭菌乳）中，脂肪水解产生的游离脂肪酸含量增 力口，最终造成产品出现脂肪氧化、酸败等不良风味。
[0003]原料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸主要有己酸（c6H12o 2)、辛酸（C8H1602)和癸酸 (c10h2Qo2)。这三种脂肪酸都具有明显而强烈的风味特征：己酸的主体风味描述为汗臭味、腐 臭味、山羊味等，风味阈值为〇· 〇93-10mg/L ;辛酸的主体风味描述为辛辣味、山羊味，风味 阈值为〇· 91-19mg/L ;癸酸的主体风味描述为哈喇味、山羊味，风味阈值为2. 2-102mg/L。这 些中链脂肪酸对原料乳和乳制品的风味影响非常明显，因此，无论是从原料乳及液体乳制 品的质量安全控制、还是干酪等发酵乳制品的风味形成角度，中链游离脂肪酸的含量都应 在乳品生产制造过程中予以监测。
[0004] 现行国家标准GB5413. 27-2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》中对乳品中 的脂肪酸测定方法进行了描述：①使用盐酸-甲醇（由乙酰氯与甲醇反应得到）使样品中 的游离脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，经气相色谱仪分离检测，外标法定量。②游离脂肪酸 在三氟化硼催化下进行甲酯化反应，经气相色谱柱分离，以氢火焰离子化检测器检测，外标 法定量。这两种方法都是使用衍生化试剂将脂肪酸甲酯化，然后通过气相色谱分离，使用外 标法定量。常用测定脂肪酸的衍生化方法虽然可以一次性检出多种脂肪酸（包括短链、中 链和长链N端脂肪酸），但步骤繁琐、重复性和回收率相对不高，在实验室和工业检测中具 有一定局限性。
[0005] 顶空固相微萃取-气相色谱质谱法联用（HS-SPME-GC/MS)技术以其快速、方便、高 效的优点，成为原料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸的常见定量检测方法。顶空固相微萃 取（Headspace solid phase micro-extraction, HS-SPME)技术集采样、萃取、浓缩、进样 为一体，结合气相色谱-质谱联用仪（GC-MS)可以实现对原料乳和乳制品等复杂混合物中 风味化合物的定量分析。游离的中链脂肪酸在固相微萃取装置的涂层（萃取头）中经过 萃取、浓缩、解吸后，在气相色谱-质谱联用仪中分离并鉴定。但是由于游离的中链脂肪酸 沸点低，在原料乳和乳制品中含量少，在极性萃取头上吸附能力相对较弱，需要对萃取头类 型、萃取平衡条件、吸附时间、萃取温度、盐（氯化钠）浓度等萃取条件，以及色谱-质谱等 分离条件进行优化，以增加中链脂肪酸在萃取头上的单位时间吸附量以及仪器对目标脂肪 酸的分离度；而且SPME-GC/MS -般使用峰面积归一法进行半定量，得到的数据只是目的中 链脂肪酸占所有风味物质的百分比，是一个比例数据。这些检测与定量方法都限制了现有 方法的准确性与精密度。
[0006] 综上所述，实验室和工业检测中急需一种操作简单、准确度高、精密度高和萃取效 率高的游离的中链脂肪酸的测定方法。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的甲酯化等衍生化方法和 HS-SPME-GC/MS方法中操作繁琐、准确度低、精密度低和萃取效率低等缺陷而提供了一种原 料乳和乳制品中游离的中链脂肪酸的测定方法，该方法操作简单、准确度高、精密度高和萃 取效率高，适用于实验室检测和样品监控。
[0008] 本发明提供了一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和 混合脂肪酸标样分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可；
[0009] 所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或 固体乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠； 当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括 内标溶液和外标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液； 所述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或 多种。
[0010] 本发明中，所述的液体乳制品为本领域常规的各种液体乳制品，所述的液体乳制 品优选为灭菌乳和/或发酵乳；所述的固体乳制品为本领域常规的各种固体乳制品，所述 的固体乳制品优选为干酪和/或干酪制品。
[0011] 本发明中，所述的水优选蒸馏水。
[0012]本发明中，如果所述的待测物为原料乳或液体乳制品，所述的待测物与所述的内 标溶液的体积比优选10:1?103:1,进一步优选50:1?150:1，更进一步优选100:1 ;所述 的待测物与所述的氯化钠的体积质量比优选lmL/g?10mL/g，进一步优选3mL/g?8mL/g， 更进一步优选5mL/g ;所述的待测样品的制备优选恒温振荡平衡，进一步优选60?振荡平 衡30分钟；所述的振荡优选在顶空瓶中进行。
[0013]本发明中，如果所述的待测物为固体乳制品，所述的待测物与所述的水的质量体 积比优选〇_ 01g/mL?lg/mL，进一步优选0· 05g/mL?0. 5g/mL，更进一步优选〇· lg/mL ;所 述的水与所述的内标溶液的体积比优选10:1?103:1，进一步优选50:1?150:1，更进一 步优选100:1 ;所述的固体乳制品优选预先处理成小块；所述的待测样品的制备优选恒温 振荡平衡，进一步优选60°C振荡平衡45分钟；所述的振荡优选在顶空瓶中进行。
[00M]本发明中，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液和所述的内标溶液的体积比 优选10:1?103:1，进一步优选50:1?150:1，更进一步优选100:1 ;所述的混合脂肪酸标 样的制备优选在顶空瓶中进行。
[0015]本发明中，所述的外标溶液中所述的乙醇水溶液优选5% (v/v)乙醇水溶液。 [0016]本发明中，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选 10mg/L?200mg/L，进一步优选45mg/L?60mg/L，更进一步优选51. 6mg/L ;所述的己酸的 纯度优选为色谱级。
[0017]本发明中，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选 10mg/L?200mg/L，进一步优选45mg/L?60mg/L，更进一步优选51· 2mg/L ;所述的辛酸的 纯度优选为色谱级。
[0018]本发明中，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选 10mg/L?200mg/L，进一步优选45mg/L?60mg/L,更进一步优选51· 9mg/L ;所述的癸酸的 纯度优选为色谱级。
[0019]本发明中，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比优选 0. lmg/mL?20mg/mL，进一步优选0· 5mg/mL?5mg/mL，更进一步优选img/mL ;所述的庚酸 的纯度优选为色谱级。
[0020]本发明一较佳实施例中，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测 样品由待测物、内标溶液和氯化钠组成。
[0021]本发明一较佳实施例中，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品由待 测物、内标溶液和水组成。
[0022]本发明一较佳实施例中，所述的混合脂肪酸标样由内标溶液和外标溶液组成。 [0023] 本发明中，所述的萃取优选固相微萃取；所述的固相微萃取优选顶空固相微萃 取；所述的固相微萃取的萃取头优选聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头，进一步优选 Supelco公司生产的65 μ m的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头；所述的固相微萃取的 萃取头优选在250°C下老化0· 5h ;所述的固相微萃取的恒温振荡平衡时间优选15分钟? 60分钟，进一步优选30分钟。
[0024] 本发明中，所述的气相色谱的条件优选如下：毛细管柱采用Varian公司生产的 VF-5ms(30mX0· 25mm，液膜厚度0· 25μπι);载气为He，流速为lmL/min ;色谱柱起始柱温为 4〇°C (保持 4min),以 1(TC /min 升到 60°C，再以 6°C /min 升到 12CTC，最后以 1(TC /min 升 到23〇°C，保持5min ;进样口温度230°C,无分流进样，检测器电压800V。
[0025] 本发明中，所述的质谱条件优选如下：电子轰击离子源（EI电离），电子能量70eV ; 灯丝发射电流200 μ A，离子源温度20(TC，传输线温度25〇°C;扫描模式Scan ;自动扫描时间 〇· 3s，扫描间隔时间〇· 2s ;质量扫描范围m/z20?2〇0。
[0026] 本发明中，较佳的定性方法如下：将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的质谱与Nist 谱库中的质谱对比；或者，将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的保留时间和质谱，与混合脂肪 酸标样在相同的GC-MS条件下测得的保留时间和质谱对比。
[0027] 本发明中，较佳的定量方法如式（1)所示：
【权利要求】
1. 一种游离的中链脂肪酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品和混合脂肪酸标样 分别经萃取，气相色谱分离，质谱检测，即可； 所述的待测样品包括待测物和内标溶液；所述的待测物为原料乳、液体乳制品或固体 乳制品；当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时，所述的待测样品还包括氯化钠；当所 述的待测物为固体乳制品时，所述的待测样品还包括水；所述的混合脂肪酸标样包括外标 溶液和内标溶液；所述的外标溶液为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多种的乙醇水溶液；所 述的内标溶液为庚酸的乙醇水溶液；所述的中链脂肪酸为己酸、辛酸和癸酸中的一种或多 种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体乳制品为灭菌乳和/或发酵乳； 和/或，所述的固体乳制品为干酪和/或干酪制品。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时， 所述的待测物与所述的内标溶液的体积比为10:1?1〇 3:1，所述的待测物与所述的氯化钠 的体积质量比为lmL/g?10mL/g ; 和/或，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测物与所述的水的质量体积比为 0. 01g/mL?lg/mL，所述的水与所述的内标溶液的体积比为10:1?103:1。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述的待测物为原料乳或液体乳制品时， 所述的待测物与所述的内标溶液的体积比为50:1?150:1，所述的待测物与所述的氯化钠 的体积质量比为3mL/g?8mL/g ; 和/或，当所述的待测物为固体乳制品时，所述的待测物与所述的水的质量体积比为 0. 05g/mL?0. 5g/mL，所述的水与所述的内标溶液的体积比为50:1?150:1。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液 和所述的内标溶液的体积比为10:1?1〇3:1 ; 和/或，所述的外标溶液中所述的乙醇水溶液为5%乙醇水溶液； 和/或，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为l〇mg/L? 200mg/L ； 和/或，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为l〇mg/L? 200mg/L ； 和/或，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为l〇mg/L? 200mg/L ； 和/或，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为〇. lmg/ mL ?20mg/mL〇
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的混合脂肪酸标样中所述的外标溶液 和所述的内标溶液的体积比为50:1?150:1 ; 和/或，所述的外标溶液中所述的己酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L? 60mg/L ； 和/或，所述的外标溶液中所述的辛酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L? 60mg/L ； 和/或，所述的外标溶液中所述的癸酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为45mg/L? 60mg/L ； 和/或，所述的内标溶液中所述的庚酸与所述的乙醇水溶液的质量体积比为0. 5mg/ mL ?5mg/mL〇
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的萃取为固相微萃取；所述的固相微萃 取的萃取头为聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取头；所述的固相微萃取的时间为15分钟? 60分钟。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的气相色谱的条件如下：毛细管柱采 用Varian公司生产的VF-5ms ;载气为He，流速为lmL/min ;色谱柱起始柱温为40°C，保持 4min，以 10°C /min 升到 60°C，再以 6°C /min 升到 120°C，最后以 10°C /min 升到 230°C，保 持5min ;进样口温度230°C，无分流进样，检测器电压800V。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：电子轰击离子源，电 子能量70eV ;灯丝发射电流200 μ A，离子源温度200°C，传输线温度250°C;扫描模式Scan ; 自动扫描时间〇. 3s，扫描间隔时间0. 2s ;质量扫描范围m/z 20?200。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，定性方法如下： 将待测样品的己酸、辛酸或癸酸的质谱与Nist谱库中的质谱对比；或者，将待测样品 的己酸、辛酸或癸酸的保留时间和质谱，与混合脂肪酸标样在相同的GC-MS条件下测得的 保留时间和质谱对比； 和/或，定量方法如式（1)所示： X A ^ I mi =-X mr 4X4 ⑴ 式中： 1? :待测样品中目标脂肪酸的含量，单位为毫克每升或毫克每百克； As :混合脂肪酸标样中内标物的峰面积； A :待测样品中目标脂肪酸的峰面积； Asi :待测样品中内标物的峰面积； 混合脂肪酸标样中目标脂肪酸的峰面积； πν :混合脂肪酸标样中目标脂肪酸含量，单位为毫克每升； 其中，所述的目标脂肪酸为己酸、辛酸或癸酸；所述的内标物为庚酸。
【文档编号】G01N30/02GK104297381SQ201410618081
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】刘景 , 任婧, 郭本恒, 刘振民 申请人:光明乳业股份有限公司