分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗ZYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株16H11，保藏号为CGMCC No.9341。杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1， kappa链。单抗与ZYMV有特异性反应。用16H11单抗建立的检测蚜虫和葫芦科植物中ZYMV的dot-ELISA检测病毒。杂交瘤细胞株16H11及单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该病毒病的诊断、预报及科学防控提供技术支撑。CGMCC No.934120140703
【专利说明】分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
【背景技术】
[0002]小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)是危害葫芦科植物的主要病毒之一，最早由Lisa于1973年在意大利北部的小西葫芦上发现，此后，世界各地均相继报道了这种病毒。我国在1991年首次发现了 ZYMV新疆分离物。至今，ZYMV已成为一种全球性的作物病毒，主要分布于温带、亚热带和热带地区，曾在意大利和法国的西葫芦上造成毁灭性的灾害。ZYMV能侵染葫芦科(Cucuribitaceae)、觅科(Amarantaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、丑科(Leguminosae)、毛莫科(Ranunculaceae)等11科植物。感病植株种子发芽率低，产量大幅度下降。在小西葫芦子叶期人工接种ZYMV，植株出现严重畸形，不能形成果实。而据国外报道，接种病毒的黄瓜产量下降64%-85%，95%的感病黄瓜无法进入市场。无论是在高度机械化农业耕作区还是传统农业耕作区，ZYMV都会导致农作物严重减产，造成巨大的经济损失。
[0003]ZYMV为马铃薯Y病毒属成员，病毒为弯曲的线状粒子，无包膜，典型的病毒粒子长度为750nm，宽llnm，无包膜。病毒粒子由4.5%~7%的核酸与93%~95.5%的蛋白质组成，含一分子线状+ssRNA，基因组大小为9.6kb。病毒粒子的致死温度为55~60°C，稀释限点为10_4~10_5，室温下可体外存活3~5天。该病毒可由多种蚜虫以非持久性方式传播，也可以进行汁液摩擦传播，还可以由种子传播，只是种子的传毒力较低。
[0004]ZYMV 能侵染葫芦科(Cucuribitaceae)、觅科(Amarantaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、丑科(Leguminosae)、毛莫科(Ranunculaceae)等11科植物。在自然条件下，感病作物的症状一般都比较严重，表现为系统花叶和大黄斑，叶片、果实不同程度的畸形，果肉僵硬且味苦涩，种子发芽率低。其中在小西葫芦上主要表现为严重系统花叶，果实畸形，表面有块状突出，甜瓜、南瓜上产生大黄斑，严重系统花叶，果实明显呈畸形。黄瓜表现为典型花叶、斑驳等。西瓜上形成褪绿斑、系统花叶，不规则的果色、形状变化等。同时，感病作物的产量大幅度降低。
[0005]目前，全球气候呈现转暖趋势，有利于以蚜虫作为自然传播媒介的ZYMV的流行与危害。一方面，气候变暖使ZYMV本身的变异率增高；其次，ZYMV的传毒蚜虫在较高温度下发育加快，增长能力提高，给病毒的快速传播创造了条件。我国的大棚栽培相当普遍，病毒及其传毒蚜虫在棚内顺利越冬后，早春即散布于棚外进行大量复制和繁殖，从而导致病害的提前发生和生长季节早期病毒累积量偏高，形成恶性循环。
[0006]针对小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的制备展开工作。当前小西葫芦黄化花叶病毒病的预警和监测体系尚不完善，甚至很多主要流行区并未进行相关预测和防控工作。另外，目前仅用田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法来检测该病毒，这几种方法效率低，并不适合大批量样品检测。而血清学的方法操作简单，特异性好，且可以同时处理大量样品，但必须依赖于特异性的病毒单抗。因此，利用杂交瘤技术制备了 I株能分泌抗ZYMV单抗的杂交瘤细胞16H11，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国小西葫芦黄化花叶病毒病的早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
[0008]分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株16H11，它能分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株16H11于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏号为CGMCC N0.9341，分类命名为:分泌抗小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)单抗杂交瘤细胞。
[0009]抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与小西葫芦黄化花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能用于传毒介体蚜虫体内小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
[0010]抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体仅与小西葫芦黄化花叶病毒有特异性免疫反应，而与西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、香蕉束顶病毒、南方水稻黑条矮缩病毒均不发生免疫反应。
[0011]抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体在抗小西葫芦黄化花叶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
[0012]本发明与现有技术相比具有的有益效果:1)提供的杂交瘤细胞株16H11分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测小西葫芦黄化花叶病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测小西葫芦黄化花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物及蚜虫中的小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是dot-ELISA方法检测ZYMV的灵敏度分析；
图2是dot-ELISA方法检测田间瓜类样品中ZYMV的结果；
【具体实施方式】
[0014]分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株16H11于2014年7月3日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏号为CGMCC N0.9341，它能分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体。
[0015]抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与小西葫芦黄化花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能用于传毒介体蚜虫体内小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
[0016]抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体仅与小西葫芦黄化花叶病毒有特异性免疫反应，而与西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、香蕉束顶病毒、南方水稻黑条矮缩病毒均不发生免疫反应。
[0017]抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
[0018]本发明提供的杂交瘤细胞株16H11能大量分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测ZYMV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间ZYMV的检测，从而为我国小西葫芦黄化花叶病毒病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
[0019]下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0020]一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
用下面的操作步骤提纯病毒粒子:
1)将大研钵和组织搅拌器预冷；
2)称取500g白南瓜病叶，每10g病叶中加入pH7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即PB缓冲液)200ml (含0.0lM Na-EDTA和0.1%巯基乙醇)，匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心(6000r/min, 20min)去植物组织残洛
3)所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG(分子量为6000) 和0.1mol/L NaCl, 4°C搅拌 4h 以上；
4)离心(11000r/min，15min)得沉淀；
5)沉淀用pH 7.5 的 0.5M PB (含 0.0lM MgCl2^P 0.5M 脲)充分洗涤，离心(6000r/min, 15min)后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；
6)合并上清液,超速离心(33000r/min,10min)所得沉淀悬浮后离心 (8000r/min,15min)；
7)合并上清液再超离心(33000r/min,10min),离心管底部加有20%_30%鹿糖垫；
8)所得沉淀用pH7.5的0.5M PB (含0.0lM MgCl2)悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；
9)用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的小西葫芦黄化花叶病毒粒子。
[0021]2.免疫动物
用ZYMV提纯病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠。即ZYMV提纯病毒粒子50μ?7只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
[0022]3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按8:1的比例，在无血清的RPM1-1640 (Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作为融合剂，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPM1-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37°C，5 % C02的细胞培养箱中培养。
[0023]4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-30%时，以感染ZYMV病毒的白南瓜叶片和提纯病毒为抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获137个阳性孔。选择15个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得I株能分泌抗ZYMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株16H11。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
[0024]5.单克隆抗体的特异性检测
用感染西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、香蕉束顶病毒、南方水稻黑条矮缩病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染小西葫芦黄化花叶病毒的病叶汁液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为:上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30(w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C过夜或37°C 2小时，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10%的脱脂奶粉或1_3% BSA或
3-6%牛血清封闭30-60min ;加入适当稀释的单抗10ul/孔，37°C 1-2小时；PBST洗涤三次后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100ul/孔，370C 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD4tl5的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，16H11单抗对ZYMV有特异性反应，而与西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、香蕉束顶病毒、南方水稻黑条矮缩病毒和健康植物均无特异性反应。
[0025]6.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min,收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取I倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水),室温下边加边搅拌，4°C澄清I小时，12000rpm离心20min,收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4°C流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，_70°C保存。
[0026]7.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果显示，16H11单抗亚类为IgGUkappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10一 7。
[0027]二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒
1.以单抗为核心建立抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法检测病毒 ACP-ELISA方法的操作步骤: (1)用0.05M碳酸盐缓冲液(PH9.6)按1:30 (w/v, g /mL)倍稀释的病叶汁液10ul/孔加入ELISA板，以ZYMV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37°C 2h，或4°C过夜；
(2)PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min ；
(3)单抗腹水5000倍稀释后10ul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗涤后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG 二抗(Sigma), 10ul/ 孔，37。。，Ih ；
(5)用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物10ul/孔，室温30min；
(6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测0D405，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。
[0028]检测结果发现该单抗建立的上述ACP-ELISA方法能很好地检测植物样品中的ZYMV病毒。
[0029]ACP-ELISA方法进行灵敏度检测
单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1:20至10240作倍比稀释分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1:5120倍稀释的病叶汁液检测仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1:5120，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
[0030]2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
2.1 dot-ELISA检测葫芦科植物中ZYMV方法的建立及田间样品的检测将白南瓜叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30 (w/v, g /11^)加入0.01 mol/LPBS (pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm离心3 min;取3 μ I上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感病白南瓜叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min ;用I3BST洗膜3_4次，每次3min ； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜
4-5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl, pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
[0031]用方阵试验确定检测白南瓜病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明16H11单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测ZYMV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当白南瓜叶片稀释到1:5120倍(w/v，g/mL)时，以16H11单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释(图1)。
[0032]用建立的dot-ELISA方法对2014年采自浙江温岭田间疑似发病葫芦科样品进行检测，结果发现，16个检测样品中有8个样品产生紫色的阳性斑点，检测结果如图2，阳性样品进一步用PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到ZYMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染ZYMV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于葫芦科样品中小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
[0033]2.2 dot-ELISA检测蚜虫体内ZYMV方法的建立及其田间样品检测单头虫牙虫放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入20 μ L PBS (0.01mol/L,PH7.4)，用牙签捣烂蚜虫后，取3 UL上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测植物中WMV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的蚜虫作为阴性和阳性对照。
[0034]用方阵试验确定检测姆虫的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度,试验表明16H11单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:6000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测蚜虫体内ZYMV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带ZYMV的蚜虫呈现蓝色斑点，而无毒的蚜虫没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测蚜虫体内的ZYMV。
[0035]用建立的dot-ELISA方法对2014年采自浙江杭州人工饲喂获毒的和无毒的蚜虫进行检测。结果发现，120头蚜虫检测样品中有65头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的蚜虫没有产生任何蓝色斑点。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到ZYMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染ZYMV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于蚜虫样品中小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
[0036]3小西葫芦黄化花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒
1)试剂盒主要成分:
ZYMV单克隆抗体I管0.2 ml
AP标记羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分别为2 ml和Iml
TMB底物I瓶10 ml
阳性对照I (含ZYMV叶片汁液)I管2 ml
阳性对照2 (带毒ZYMV蚜虫匀浆液)I管2 ml
阴性对照I (健康白南瓜叶片汁液)I管2 ml
阴性对照2 (非带毒蚜虫匀浆液)I管2 ml
抗体稀释液(10X) I瓶80ml
以上试剂均保存于4°C下硝酸纤维素膜(NC) 10张
2)检测葫芦科植物样品的操作步骤:
a.将葫芦科样品叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v,g /mL)加入0.01mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm离心3 min;
c.取3μ I上清点到NC上，同时设置健康和感病白南瓜叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ；
e.NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min ；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min ； NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min;
g.PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl, pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；
h.待阳性对照显色明显(紫色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
[0037]3)检测蚜虫样品的操作步骤:
a.单头虫牙虫放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入10-50 μ L PBS (0.0lmol/L，ρΗ7.4)，用牙签捣烂蚜虫后，取3 UL上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的蚜虫分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min ；
b.NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ；
c.NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min ；
d.用PBST洗膜3?4次，每次3min ； NC膜放入1:6000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30?60 min ；
e.PBST洗膜4?5次，每次3 min ;膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；
f.待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
[0038]3)保存及有效期于2?8°C避光保存，有效期12个月。
[0039]4)缓冲液配方:
磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):
NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO412H203g
叠氮化钠0.2 g
加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml ELISA 洗涤液(0.01 mol/L PBST):
1000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20
ELISA封闭液:
0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5% (W/V)。
【权利要求】
1.一种分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株16H11，其特征在于能分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株16H11于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.9341。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株16H11分泌的抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10_7，抗体类型及亚类为IgGUkappa链,该单克隆抗体能与小西葫芦黄化花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能用于传毒介体蚜虫体内小西葫芦黄化花叶病毒的检测。
3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株16H11分泌的抗小西葫芦黄化花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体仅与小西葫芦黄化花叶病毒有特异性免疫反应，而与西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、柑橘碎叶病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、香蕉束顶病毒、南方水稻黑条矮缩病毒均不发生免疫反应。
4.一种如权利要求2所述的抗小西葫芦黄化花叶病毒单克隆抗体在小西葫芦黄化花叶病毒检测上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
【文档编号】G01N33/569GK104513809SQ201410627353
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】吴建祥, 周雪平, 陈浙, 宋革 申请人:浙江大学